产品简介：
HIV（人类免疫缺陷病毒）骨架的慢病毒载体是目前最常用的慢病毒表达载体，它能在体外或体内实验有效介导外源基因转导多种分化或非分化哺乳动物细胞，使外源基因稳定整合靶细胞的基因组，并进行稳定的高水平表达。
Psaitong慢病毒包装系统是安全性较高的第三代慢病毒包装系统（兼容第二代慢病毒包装系统），表达载体自身失活，不产生额外的慢病毒复制。
慢病毒包装系统可将HIV 载体的慢病毒表达克隆包装成为具有转导效果的慢病毒颗粒，包装所得的慢病毒颗粒可立即使用，介导目的基因在哺乳动物细胞进行高效表达。该试剂盒适用于40000 多种人源及小鼠源的慢病毒载体ORF 表达克隆，以及针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶基因的慢病毒载体shRNA 克隆。除此以外，还同时适用于20000 多种人源慢病毒载体miRNA 前体表达克隆、miRNA 抑制剂表达克隆以及启动子报告克隆，18000 种小鼠的慢病毒载体启动子报告克隆。以上所有克隆均应用HIV 骨架，可随时应用于慢病毒包装。
Psaitong慢病毒包装系统是安全性较高的第三代慢病毒包装系统（兼容第二代慢病毒包装系统），表达载体自身失活，不产生额外的慢病毒复制。
慢病毒包装系统可将HIV 载体的慢病毒表达克隆包装成为具有转导效果的慢病毒颗粒，包装所得的慢病毒颗粒可立即使用，介导目的基因在哺乳动物细胞进行高效表达。该试剂盒适用于40000 多种人源及小鼠源的慢病毒载体ORF 表达克隆，以及针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶基因的慢病毒载体shRNA 克隆。除此以外，还同时适用于20000 多种人源慢病毒载体miRNA 前体表达克隆、miRNA 抑制剂表达克隆以及启动子报告克隆，18000 种小鼠的慢病毒载体启动子报告克隆。以上所有克隆均应用HIV 骨架，可随时应用于慢病毒包装。
操作步骤：
以下步骤是使用293T 工具细胞包装生产慢病毒颗粒的标准操作流程。需要注意的是，针对不同长度、对包装细胞有不同危害程度目的基因，慢病毒滴度将根据实际情况而出现差异。
一：D-2 天
1：293T 接种：提前两天将数量接种293T 细胞到10cm 培养皿，使细胞在进行转染的当天达到~80%融合率，接种密度标准如说明书表1。
二：D0天
1：转染前准备：37℃水浴预热无血清DMEM（约10mL/皿）和PBS（约10mL/皿）, 30 mins。
2：转染前换液：转染前弃去旧的细胞培养液，预热的3-5 mL PBS 清洗一遍，加入预热无血清DMEM（约10mL/皿），并放入孵箱平衡。（注意：293T 细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞）
3：准备PEI/DNA 转染复合物:
配置PEI：取无菌EP 管（标记为管1），加入（A）PEI-Hipro Reagent 转染试剂60μL，再添加PEI/DNA Mixing Buffer 补齐至500μL。
配置DNA：取另一无菌EP 管（标记为管2），加入无内毒慢病毒载体的表达质粒10μg、及本试剂盒中的（B）Lentiviral Plasmid Mix 混合包装质粒10μL（1 μg/μL），再添加（C）PEI/DNA Mixing Buffer 补齐至500μL（此时，管2的质粒总量是20μg）。
PEI 加入到DNA：将管1 的PEI 溶液缓慢加入到管2 的总DNA 中（注意：请勿颠倒添加顺序），轻轻混匀后，室温放置孵育10min，形成PEI/DNA 转染复合物。
4：逐滴添加PEI/DNA 转染复合物：往培养皿中缓慢逐滴添加PEI/DNA 转染复合物，轻柔水平8字晃动混匀。
注意：虽然有蛋白的环境（如10%血清）对转染步骤无影响，但不利于PEI/DNA 转染复合物的形成，所以本步骤推荐使用（C）PEI/DNA Mixing Buffer。每1μg 质粒添加3μLPEI-Hipro Reagent（高效转染试剂）试剂是最佳比例；如继续提高转染试剂的添加比例，转染效率不会继续出现明显提高。
5：转染后5-8 小时换液（注意避免细胞漂起）：吸弃含有转染复合物的旧培养液，（这里不需要PBS 润洗），直接添加预热的2% FBS 的DMEM 培养液（例如10 cm 培养板需添加10 mL DMEM）。在这一步骤，可向新鲜DMEM 培养液添加1/100 体积的（D）Titer Enhancer (100X)滴度增强剂（例如10 cm 培养板需添加100μL 的Titer Enhancer(100X)），并继续在5% CO2、37℃的条件下培养，准备收获慢病毒颗粒。
注意：需要在转染操作后的5~8 小时内去除含转染复合物的旧培养液，以新鲜培养液继续培养细胞。转染复合物对细胞状态有一定负面影响，不宜长时间接触细胞，更换新鲜培养液更利于获得高滴度慢病毒颗粒。
Titer Enhancer (100X)滴度增强剂在其通常浓度下(1×)，可显著提升慢病毒产物滴度2-3倍。Titer Enhancer (100X)试剂使用后容易去除，在通常的慢病毒纯化步骤如离心、超滤或层析等过程中即可轻松除去，不残留在病毒液中。但如果使用未经纯化的病毒液直接感染靶细胞，病毒液的添加量不可超过培养容积的1/10，否则易对靶细胞产生不利影响。TiterEnhancer(100X)滴度增强剂在体系中的浓度低于0.05×时， 它对哺乳动物细胞的负面影响可忽略不计。推荐先对病毒液进行纯化再使用、或预先对靶细胞做梯度感染测试。
三：D3天
6：收集原液：48 小时后收集含有病毒的上清培养液至50 mL 离心管中，1500 rpm 离心10min。
7：过滤除杂：将上清用0.45μm的针头滤器过滤，除去细胞碎片，即得到病毒原液。病毒原液可直接用于细胞感染，若暂时不使用，请及时分装并于-70℃以下储存。
注意：通常在转染操作后24-48小时是慢病毒产量的峰值，推荐在转染后48小时收集一次即可。如您希望单次获得更多病毒量，可在转染操作后36、48、60小时各收集一次培养液，在36小时和48小时收集后重新添加新鲜的（含2%热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、Titer Enhancer(100X)滴度增强剂）的DMEM 培养液，以便继续收集。 请勿使用硝酸纤维素膜过滤慢病毒液进行纯化。硝酸纤维素膜可与慢病毒结合，使过滤后的产物滴度降低。
8：浓缩纯化
病毒原液经过浓缩纯化后可大大提高病毒滴度和纯度，能更高效感染细胞。
常用有3 种方法：
a：超高速离心法（推荐用于动物实验）：离心力在90000g 以上，按超高速离心步骤进行。
b：超滤浓缩（推荐构建稳转细胞系）：移液器转移病毒液至15mL 超滤管（MilliporeUltra-15; 100kD）中，浓缩至0.2-1mL。
C：【推荐】：慢病毒浓缩液（5×）能对所有类型的慢病毒颗粒进行简单快速的浓缩。该浓缩液操作简单，仅需将5×浓缩液与慢病毒上清按比例混合并短时间孵育，然后使用普通的离心机离心（4℃，4000g 离心25mins），即可得到浓缩的慢病毒颗粒，回收率高达90%以上，可提高100倍病毒滴度。
一：D-2 天
1：293T 接种：提前两天将数量接种293T 细胞到10cm 培养皿，使细胞在进行转染的当天达到~80%融合率，接种密度标准如说明书表1。
二：D0天
1：转染前准备：37℃水浴预热无血清DMEM（约10mL/皿）和PBS（约10mL/皿）, 30 mins。
2：转染前换液：转染前弃去旧的细胞培养液，预热的3-5 mL PBS 清洗一遍，加入预热无血清DMEM（约10mL/皿），并放入孵箱平衡。（注意：293T 细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞）
3：准备PEI/DNA 转染复合物:
配置PEI：取无菌EP 管（标记为管1），加入（A）PEI-Hipro Reagent 转染试剂60μL，再添加PEI/DNA Mixing Buffer 补齐至500μL。
配置DNA：取另一无菌EP 管（标记为管2），加入无内毒慢病毒载体的表达质粒10μg、及本试剂盒中的（B）Lentiviral Plasmid Mix 混合包装质粒10μL（1 μg/μL），再添加（C）PEI/DNA Mixing Buffer 补齐至500μL（此时，管2的质粒总量是20μg）。
PEI 加入到DNA：将管1 的PEI 溶液缓慢加入到管2 的总DNA 中（注意：请勿颠倒添加顺序），轻轻混匀后，室温放置孵育10min，形成PEI/DNA 转染复合物。
4：逐滴添加PEI/DNA 转染复合物：往培养皿中缓慢逐滴添加PEI/DNA 转染复合物，轻柔水平8字晃动混匀。
注意：虽然有蛋白的环境（如10%血清）对转染步骤无影响，但不利于PEI/DNA 转染复合物的形成，所以本步骤推荐使用（C）PEI/DNA Mixing Buffer。每1μg 质粒添加3μLPEI-Hipro Reagent（高效转染试剂）试剂是最佳比例；如继续提高转染试剂的添加比例，转染效率不会继续出现明显提高。
5：转染后5-8 小时换液（注意避免细胞漂起）：吸弃含有转染复合物的旧培养液，（这里不需要PBS 润洗），直接添加预热的2% FBS 的DMEM 培养液（例如10 cm 培养板需添加10 mL DMEM）。在这一步骤，可向新鲜DMEM 培养液添加1/100 体积的（D）Titer Enhancer (100X)滴度增强剂（例如10 cm 培养板需添加100μL 的Titer Enhancer(100X)），并继续在5% CO2、37℃的条件下培养，准备收获慢病毒颗粒。
注意：需要在转染操作后的5~8 小时内去除含转染复合物的旧培养液，以新鲜培养液继续培养细胞。转染复合物对细胞状态有一定负面影响，不宜长时间接触细胞，更换新鲜培养液更利于获得高滴度慢病毒颗粒。
Titer Enhancer (100X)滴度增强剂在其通常浓度下(1×)，可显著提升慢病毒产物滴度2-3倍。Titer Enhancer (100X)试剂使用后容易去除，在通常的慢病毒纯化步骤如离心、超滤或层析等过程中即可轻松除去，不残留在病毒液中。但如果使用未经纯化的病毒液直接感染靶细胞，病毒液的添加量不可超过培养容积的1/10，否则易对靶细胞产生不利影响。TiterEnhancer(100X)滴度增强剂在体系中的浓度低于0.05×时， 它对哺乳动物细胞的负面影响可忽略不计。推荐先对病毒液进行纯化再使用、或预先对靶细胞做梯度感染测试。
三：D3天
6：收集原液：48 小时后收集含有病毒的上清培养液至50 mL 离心管中，1500 rpm 离心10min。
7：过滤除杂：将上清用0.45μm的针头滤器过滤，除去细胞碎片，即得到病毒原液。病毒原液可直接用于细胞感染，若暂时不使用，请及时分装并于-70℃以下储存。
注意：通常在转染操作后24-48小时是慢病毒产量的峰值，推荐在转染后48小时收集一次即可。如您希望单次获得更多病毒量，可在转染操作后36、48、60小时各收集一次培养液，在36小时和48小时收集后重新添加新鲜的（含2%热灭活胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、Titer Enhancer(100X)滴度增强剂）的DMEM 培养液，以便继续收集。 请勿使用硝酸纤维素膜过滤慢病毒液进行纯化。硝酸纤维素膜可与慢病毒结合，使过滤后的产物滴度降低。
8：浓缩纯化
病毒原液经过浓缩纯化后可大大提高病毒滴度和纯度，能更高效感染细胞。
常用有3 种方法：
a：超高速离心法（推荐用于动物实验）：离心力在90000g 以上，按超高速离心步骤进行。
b：超滤浓缩（推荐构建稳转细胞系）：移液器转移病毒液至15mL 超滤管（MilliporeUltra-15; 100kD）中，浓缩至0.2-1mL。
C：【推荐】：慢病毒浓缩液（5×）能对所有类型的慢病毒颗粒进行简单快速的浓缩。该浓缩液操作简单，仅需将5×浓缩液与慢病毒上清按比例混合并短时间孵育，然后使用普通的离心机离心（4℃，4000g 离心25mins），即可得到浓缩的慢病毒颗粒，回收率高达90%以上，可提高100倍病毒滴度。
自备材料：
1：慢病毒载体ORF、shRNA 及miRNA 表达质粒（推荐使用Stbl3 菌进行发酵生产，并制备去内毒素质粒）。
2：293T 包装细胞（注意细胞状态，细胞状态极大地影响慢病毒滴度）。
3：DMEM 培养基及胎牛血清。
4：其他常用实验耗材（如10cm 培养皿，50ml 离心管等）。
5：滴度检测细胞：293T 细胞系用于测定慢病毒滴度、检验转导效果。
2：293T 包装细胞（注意细胞状态，细胞状态极大地影响慢病毒滴度）。
3：DMEM 培养基及胎牛血清。
4：其他常用实验耗材（如10cm 培养皿，50ml 离心管等）。
5：滴度检测细胞：293T 细胞系用于测定慢病毒滴度、检验转导效果。
原理：
本慢病毒表达系统由加强了生物安全特性、并可提高产物滴度的第三代慢病毒载体系统优化所得。在该系统中，慢病毒表达质粒与慢病毒包装试剂盒通过共转染，使重组慢病毒质粒于293T 包装细胞中表达并包装成为具有感染活性的慢病毒颗粒、并分泌进入细胞培养液。
本系统产生的慢病毒以疱疹性口炎病毒G蛋白（VSVG）作为表型，具有广泛的细胞亲和性和较高的滴度。慢病毒表达质粒（装载目的基因）含有慢病毒包装、转导、整合至染色体组DNA 并稳定表达目标基因所需的组分。但是，它缺乏转录和包装这些RNA拷贝到慢病毒的组分，这些组分由慢病毒包装试剂盒中的组分B：Lentiviral Plasmid Mix(包装辅助质粒混合物)提供，包含慢病毒骨架表达、调控、复制相关的基因。
本系统产生的慢病毒以疱疹性口炎病毒G蛋白（VSVG）作为表型，具有广泛的细胞亲和性和较高的滴度。慢病毒表达质粒（装载目的基因）含有慢病毒包装、转导、整合至染色体组DNA 并稳定表达目标基因所需的组分。但是，它缺乏转录和包装这些RNA拷贝到慢病毒的组分，这些组分由慢病毒包装试剂盒中的组分B：Lentiviral Plasmid Mix(包装辅助质粒混合物)提供，包含慢病毒骨架表达、调控、复制相关的基因。
保存条件：
RT 一年
注意事项：
1：须使用去内毒素的转染级别质粒。制备去内毒素质粒DNA。
2：DNA 纯度。通过260 nm/280nm 比值在1.8 -2.0 范围内为宜，并通过琼脂糖电泳检测DNA 完整性。如质粒在使用前经历了较长的储存时间，则建议先检测质粒DNA 状态，再进行包装操作。
3：必须使用生长状态良好、连续传代的包装工具细胞（293T）。请确保细胞培养液无细菌、真菌或支原体污染；如细胞刚从液氮罐取出并复苏，请先让该细胞传代至少两次，再用于慢病毒包装，细胞汇合度应在70-85%。细胞状态极大地影响慢病毒滴度。
2：DNA 纯度。通过260 nm/280nm 比值在1.8 -2.0 范围内为宜，并通过琼脂糖电泳检测DNA 完整性。如质粒在使用前经历了较长的储存时间，则建议先检测质粒DNA 状态，再进行包装操作。
3：必须使用生长状态良好、连续传代的包装工具细胞（293T）。请确保细胞培养液无细菌、真菌或支原体污染；如细胞刚从液氮罐取出并复苏，请先让该细胞传代至少两次，再用于慢病毒包装，细胞汇合度应在70-85%。细胞状态极大地影响慢病毒滴度。
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
参考文献 & 客户发表文献
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
