产品简介：
⼀款⽅便且操作简单的试剂盒，利⽤SYTO9绿⾊核酸染料和碘化丙啶（PI）红⾊荧光核酸染料来进⾏细菌活⼒的检测，适⽤于⼤量的细菌种属，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产⽓荚膜杆菌、⼤肠杆菌、肺炎克雷伯⽒菌、草分枝杆菌、绿脓杆菌、⾦黄葡萄球菌、奥拉尼堡沙门⽒菌、宋内志贺
⽒菌和化脓性链球菌。
本试剂盒的⼯作原理在于：SYTO 9和PI的光谱特征以及穿透健康细菌细胞的能⼒不同。单独使⽤时，SYTO 9能对群体内的所有细菌进⾏标记—具有完整膜和受损膜的细菌；相反，PI 只能渗透进⼊受损的膜，PI 的插⼊会引起SYTO 9染⾊荧光的降低，当体系内加⼊两种染料时。因此，通过适量⽐例的SYTO 9和PI的混合染⾊，具有完整膜结构的细菌呈绿⾊荧光，⽽具受损膜结构的细菌呈红⾊荧光。两者染料的最⼤激发和发射波长分别是480/500nm（SYTO 9）和490/635nm（PI）。背景基本无荧光。本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。
本试剂盒的⼯作原理在于：SYTO 9和PI的光谱特征以及穿透健康细菌细胞的能⼒不同。单独使⽤时，SYTO 9能对群体内的所有细菌进⾏标记—具有完整膜和受损膜的细菌；相反，PI 只能渗透进⼊受损的膜，PI 的插⼊会引起SYTO 9染⾊荧光的降低，当体系内加⼊两种染料时。因此，通过适量⽐例的SYTO 9和PI的混合染⾊，具有完整膜结构的细菌呈绿⾊荧光，⽽具受损膜结构的细菌呈红⾊荧光。两者染料的最⼤激发和发射波长分别是480/500nm（SYTO 9）和490/635nm（PI）。背景基本无荧光。本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。
操作步骤：
一：培养条件和细菌悬液的制备
1：用营养⾁汤培养⼤肠杆菌或⾦黄⾊葡萄球菌（30ml）使其⽣长⾄对数⽣长后期。
2：于10000×g离⼼10-15min，浓缩25ml细菌培养物。
3：吸⾛上清液，⽤2ml 0.85% NaCl或适当缓冲液来重悬沉淀。
4：取1ml重悬菌液分别加⼊含20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液的30-40ml离⼼管（⽤作活细菌），或含20ml 70%异丙醇的30-40ml离⼼管（⽤作杀死细菌）。
5：两管样品于室温孵育1h，每隔15min颠倒混匀⼀次。
6：两管样品于10000×g离心10-15min。
7：⽤20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀，并且按照步骤6再离⼼⼀次。
8：分别⽤10ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬两管样品。
9：分别取3ml菌液测定670nm的光密度（OD670），⽤玻璃或丙烯酸酯⽐⾊⽫（1cm路径）。
10：对于⼤肠杆菌或金黄⾊葡萄球菌的建议染⾊浓度，根据你的仪器类型（荧光显微镜、荧光光度经、荧光酶标仪）或流式细胞仪来参考相应部分的染色条件。
二：染⾊条件的优化
试剂盒内的两种染料都经过平衡优化，按照1：1的⽐例进⾏混合⽤于绝⼤多数的样本都能得到良好的区分活/死细菌。偶然情况下，两种染料的混合⽐例需根据实际需求进⾏优化调整。⽐如：在待检样本中，绿⾊荧光太突出，建议要么降低SYTO 9浓度，要么提⾼PI浓度。
为了全⾯优化染⾊条件，建议测试梯度浓度的SYTO 9，每⼀种浓度与梯度浓度的PI进⾏组合染⾊。建议按照1ml细菌悬液加⼊3μl不同混合⽐率的染料预混液。
三：荧光显微镜操作步骤
活菌和死菌的荧光可能⽤标准的荧光素长通滤⽚设置来同时观察。替代方案：活菌（绿⾊荧光）和死菌（红⾊荧光）可分别用荧光素和Texas Red带通滤光⽚设置。⽤于本试剂盒检测的建议荧光显微镜滤⽚设置见表1。
1：在微量离⼼管内组合等量的组分A（SYTO 9）和组分B（PI），混匀。
2：每1ml细菌悬液内加⼊3μl染料预混液。按照建议的稀释倍数，最终得到的染⾊⼯作液内含0.3% DMSO。更⾼浓度的DMSO可能对染⾊产⽣副效果。
3：混匀后室温避光孵育15min。
4：吸5μl染⾊的细菌悬液到载玻⽚上，并盖上18mm⽅形盖玻⽚。
5：根据表1选择荧光显微镜上合适的滤⽚来观察。
四：荧光光度计操作步骤
1：调整⼤肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为1×108个细菌/ml(~0.03 OD670)或⾦黄⾊葡萄球菌悬液（活和杀死）使其密度为1×107个细菌/ml (~0.15 OD670)。⽤于荧光光度计检测，⾦黄⾊葡萄球菌悬液的浓度通常⽐大肠杆菌少10倍。
2：参考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或⽯英荧光⽐⾊⽫混匀五种不同⽐例的细菌悬液。每个样本的总体积为3ml。表2.荧光光度计法检测活/死细菌所需不同⽐例活细菌和死细菌悬液的加量体积
3：在微量离⼼管内分别加30μl组分A（SYTO 9）和30μl组分B（PI），混匀。
4：每组不同⽐例的细菌悬液内加⼊9μl染料预混液（5个样本×9μl =45μl总量），⽤枪上下吹打数次使其混匀。
5：室温避光孵育15min。
6：荧光测定和数据分析
⽤荧光光度计测定每组细菌悬液（Fcell）的荧光发射光谱（激发：470nm，发射：490-700nm）。
分别测定发射光谱在510-540nm（em1，绿⾊）和620-650nm（em2，红⾊）的累积荧光，并计算累积荧光⽐值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
以⼤肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以累积绿色荧光与红⾊荧光比（RatioG/R）为纵坐标，制图。
五：荧光酶标仪操作步骤
针对细菌悬液，⽤荧光酶标仪的测定条件与荧光光度计的基本类似。如同荧光光度计的检测步骤，染料浓度相同于荧光显微镜的建议浓度，绿/红荧光比与活细菌相对数量呈正比。
1：调整⼤肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为2×108个细菌/ml（~0.06 OD670）或⾦黄⾊葡萄球菌悬液（活和杀死）使其密度为2×107个细菌/ml（~0.3 OD670）。⽤于荧光酶标仪检测，⾦黄⾊葡萄球菌悬液的浓度通常⽐⼤肠杆菌少10倍。
2：参考表3在16×125mm⾼硼硅玻璃培养管内混匀五种不同⽐例的细菌悬液（⼤肠杆菌或⾦黄⾊葡萄球菌）。每个样本的总体积为2ml。
3：在微量离⼼管内分别加6μl组分A（SYTO 9）和6μl组分B（PI），混匀。
4：通过将所有的12μl上述预混液加⼊2ml⽆菌的dH2O，混匀后制备2×染⾊混合液。
5：吸100μl细菌悬液混合物到平底96孔板的各孔内，建议每个制备物做三个平⾏。96孔板的边缘孔通常空置以避免假读数。
6：更换新的枪头，每孔加⼊100μl 2×染⾊混合液，上下吹打使充分混匀。
7：室温避光孵育15min。
8：荧光测定和数据分析
以~485nm为激发波长，~530nm为发射波长（emission 1，绿⾊）来测定每孔荧光；
以~485nm为激发波长，~630nm为发射波长（emission 2，红⾊）来测定每孔荧光；
通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光⽐值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
以⼤肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以RatioG/R为纵坐标，制图。
1：用营养⾁汤培养⼤肠杆菌或⾦黄⾊葡萄球菌（30ml）使其⽣长⾄对数⽣长后期。
2：于10000×g离⼼10-15min，浓缩25ml细菌培养物。
3：吸⾛上清液，⽤2ml 0.85% NaCl或适当缓冲液来重悬沉淀。
4：取1ml重悬菌液分别加⼊含20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液的30-40ml离⼼管（⽤作活细菌），或含20ml 70%异丙醇的30-40ml离⼼管（⽤作杀死细菌）。
5：两管样品于室温孵育1h，每隔15min颠倒混匀⼀次。
6：两管样品于10000×g离心10-15min。
7：⽤20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀，并且按照步骤6再离⼼⼀次。
8：分别⽤10ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬两管样品。
9：分别取3ml菌液测定670nm的光密度（OD670），⽤玻璃或丙烯酸酯⽐⾊⽫（1cm路径）。
10：对于⼤肠杆菌或金黄⾊葡萄球菌的建议染⾊浓度，根据你的仪器类型（荧光显微镜、荧光光度经、荧光酶标仪）或流式细胞仪来参考相应部分的染色条件。
二：染⾊条件的优化
试剂盒内的两种染料都经过平衡优化，按照1：1的⽐例进⾏混合⽤于绝⼤多数的样本都能得到良好的区分活/死细菌。偶然情况下，两种染料的混合⽐例需根据实际需求进⾏优化调整。⽐如：在待检样本中，绿⾊荧光太突出，建议要么降低SYTO 9浓度，要么提⾼PI浓度。
为了全⾯优化染⾊条件，建议测试梯度浓度的SYTO 9，每⼀种浓度与梯度浓度的PI进⾏组合染⾊。建议按照1ml细菌悬液加⼊3μl不同混合⽐率的染料预混液。
三：荧光显微镜操作步骤
活菌和死菌的荧光可能⽤标准的荧光素长通滤⽚设置来同时观察。替代方案：活菌（绿⾊荧光）和死菌（红⾊荧光）可分别用荧光素和Texas Red带通滤光⽚设置。⽤于本试剂盒检测的建议荧光显微镜滤⽚设置见表1。
1：在微量离⼼管内组合等量的组分A（SYTO 9）和组分B（PI），混匀。
2：每1ml细菌悬液内加⼊3μl染料预混液。按照建议的稀释倍数，最终得到的染⾊⼯作液内含0.3% DMSO。更⾼浓度的DMSO可能对染⾊产⽣副效果。
3：混匀后室温避光孵育15min。
4：吸5μl染⾊的细菌悬液到载玻⽚上，并盖上18mm⽅形盖玻⽚。
5：根据表1选择荧光显微镜上合适的滤⽚来观察。
四：荧光光度计操作步骤
1：调整⼤肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为1×108个细菌/ml(~0.03 OD670)或⾦黄⾊葡萄球菌悬液（活和杀死）使其密度为1×107个细菌/ml (~0.15 OD670)。⽤于荧光光度计检测，⾦黄⾊葡萄球菌悬液的浓度通常⽐大肠杆菌少10倍。
2：参考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或⽯英荧光⽐⾊⽫混匀五种不同⽐例的细菌悬液。每个样本的总体积为3ml。表2.荧光光度计法检测活/死细菌所需不同⽐例活细菌和死细菌悬液的加量体积
3：在微量离⼼管内分别加30μl组分A（SYTO 9）和30μl组分B（PI），混匀。
4：每组不同⽐例的细菌悬液内加⼊9μl染料预混液（5个样本×9μl =45μl总量），⽤枪上下吹打数次使其混匀。
5：室温避光孵育15min。
6：荧光测定和数据分析
⽤荧光光度计测定每组细菌悬液（Fcell）的荧光发射光谱（激发：470nm，发射：490-700nm）。
分别测定发射光谱在510-540nm（em1，绿⾊）和620-650nm（em2，红⾊）的累积荧光，并计算累积荧光⽐值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
以⼤肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以累积绿色荧光与红⾊荧光比（RatioG/R）为纵坐标，制图。
五：荧光酶标仪操作步骤
针对细菌悬液，⽤荧光酶标仪的测定条件与荧光光度计的基本类似。如同荧光光度计的检测步骤，染料浓度相同于荧光显微镜的建议浓度，绿/红荧光比与活细菌相对数量呈正比。
1：调整⼤肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为2×108个细菌/ml（~0.06 OD670）或⾦黄⾊葡萄球菌悬液（活和杀死）使其密度为2×107个细菌/ml（~0.3 OD670）。⽤于荧光酶标仪检测，⾦黄⾊葡萄球菌悬液的浓度通常⽐⼤肠杆菌少10倍。
2：参考表3在16×125mm⾼硼硅玻璃培养管内混匀五种不同⽐例的细菌悬液（⼤肠杆菌或⾦黄⾊葡萄球菌）。每个样本的总体积为2ml。
3：在微量离⼼管内分别加6μl组分A（SYTO 9）和6μl组分B（PI），混匀。
4：通过将所有的12μl上述预混液加⼊2ml⽆菌的dH2O，混匀后制备2×染⾊混合液。
5：吸100μl细菌悬液混合物到平底96孔板的各孔内，建议每个制备物做三个平⾏。96孔板的边缘孔通常空置以避免假读数。
6：更换新的枪头，每孔加⼊100μl 2×染⾊混合液，上下吹打使充分混匀。
7：室温避光孵育15min。
8：荧光测定和数据分析
以~485nm为激发波长，~530nm为发射波长（emission 1，绿⾊）来测定每孔荧光；
以~485nm为激发波长，~630nm为发射波长（emission 2，红⾊）来测定每孔荧光；
通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光⽐值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
以⼤肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以RatioG/R为纵坐标，制图。
| 表1 | ||
| XF25, XF26, XF115 | 11001, 41012, 71010 | ⽤于同时观察SYTO 9和PI染⾊的长通和双发射滤光⽚ |
| XF22, XF23 | 31001, 41001 | 仅用于观察SYTO 9的带通滤光⽚ |
| XF32, XF43, XF102, XF108 | 31002, 31004, 41002, 4100 | 仅用于观察PI的带通滤光⽚ |
| 表2 | ||
| 活：死 细菌比例 | mL活细菌悬液 | mL死细菌悬液 |
| 0:100 | 0 | 3.0 |
| 10:90 | 0.3 | 2.7 |
| 50:50 | 1.5 | 1.5 |
| 90:10 | 2.7 | 0.3 |
| 100:0 | 3.0 | 0 |
| 表3荧光酶标仪法检测活/死细菌所需不同⽐例活细菌和死细菌悬液的加量体积 | ||
| 活：死细菌比例 | mL活细菌悬液 | mL死细菌悬液 |
| 0:100 | 0 | 2.0 |
| 10:90 | 0.2 | 1.8 |
| 50:50 | 1.0 | 1.0 |
| 90:10 | 1.8 | 0.2 |
| 100:0 | 2.0 | 0 |
组分：
| 组分名称 | 规格(40T) | 储存 |
| SYTO 9 Solution(3.34mM) | 60μl | -20°C |
| PI Solution（20mM） | 60μl | -20°C |
| 自备：Mounting oil, for bacteria immobilized on membranes | ||
保存条件：
-20℃ 一年
注意事项：
1：由于试剂盒内SYTO 9和PI的组分量少，室温回温充分融化后，务必低速离⼼沉⾄管底后再开盖。
2：第⼀次使⽤可将SYTO 9和PI根据单次⽤量分装保存，密封后置于≤-20℃避光保存。
3：Mounting oil, for bacteria immobilized on membranes⽤于将细菌固定在膜上，25℃的折射率是1.517 ± 0.003。不要⽤作浸油（Immersion oil）。
4：SYTO 9和PI结合核酸，PI是潜在的诱变剂，⽬前没有数据阐明SYTO 9的诱变性或毒性，两种试剂使⽤都需做恰当防护。DMSO能促进有机分⼦进⼊组织。强烈建议处理DMSO储存液时戴双层⼿套。对于核酸染料，含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进⾏废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。
5：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴⼀次性⼿套操作。
2：第⼀次使⽤可将SYTO 9和PI根据单次⽤量分装保存，密封后置于≤-20℃避光保存。
3：Mounting oil, for bacteria immobilized on membranes⽤于将细菌固定在膜上，25℃的折射率是1.517 ± 0.003。不要⽤作浸油（Immersion oil）。
4：SYTO 9和PI结合核酸，PI是潜在的诱变剂，⽬前没有数据阐明SYTO 9的诱变性或毒性，两种试剂使⽤都需做恰当防护。DMSO能促进有机分⼦进⼊组织。强烈建议处理DMSO储存液时戴双层⼿套。对于核酸染料，含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进⾏废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。
5：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴⼀次性⼿套操作。
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
参考文献 & 客户发表文献
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
