产品简介：
⼀种⽤于检测免疫印迹膜上辣根过氧化物酶（HRP）的⾼灵敏的增强底物。该物底极强的信号输出能够使⽪克量的抗原得到检测。信号的敏感度、强度和持续时间使利⽤照相或者其他成像⽅式检测成为可能。印迹膜可以反复在胶⽚上曝光以获得最佳效果，也可以先将膜上的免疫检测试剂进⾏剥离并重新检测。
操作步骤：
蛋⽩印迹法详细操作步骤
优化抗原和抗体的浓度。必须使用建议抗体稀释度，以保证阳性结果。建议的稀释度范围请参考其他所需材料。
一：将一抗从1mg/ml储备液稀释到0.2～1.0ug/ml或1:1.000～1：5.000稀释度
二：将二抗从1mg/ml储备液稀释到10～50ng/ml或1:20.000～1：100.000稀释度
三：将两种底物组份按1:1比例混合，制备底物工作液。
四：将印迹膜在Femto ECL & Dura ECL底物工作液中孵育5分钟。
五：吸出多余试剂。用清洁的塑料膜盖住该印迹膜。
六：使印迹膜在X光胶片上曝光。
1：将印记膜从蛋白转印设备中取出，加⼊合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟，同时振荡。以封闭膜上⾮特异性蛋白结合位点。
注意：使用在前文其他所需材料章节中建议的抗体稀释度是⾮常重要的。
2：将膜从封闭液中取出，与⼀抗⼯作液在温室孵育1小时，同时振荡；或在28℃孵育过夜，不振荡。
3：将⾜量的洗涤缓冲液加⾄膜上，保证缓冲液将膜完全覆盖。振荡孵育≥5分钟，更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。
注：孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。
使⽤在前⽂其他所需材料章节中建议的HRP标记⼆抗稀释度是⾮常重要的。
4：将HRP标记的⼆抗⼯作液与膜在温室孵育1小时，同时振荡。
5：重复步骤3，以除去未结合的HRP标记⼆抗。注：膜与HRP标记⼆抗孵育后必须进⾏彻底洗涤。
6：将A溶液与B液等⽐例混合，制备成⼯作液。每cm2膜使⽤0.01-0.1ml⼯作液。⼯作液可以在温室下稳定8小时。
注：暴露于⽇光或任何其他强光下可能损害⼯作液，为获得最佳结果，将此⼯作液保存在琥珀⾊瓶中，并避免长期暴露于任何强光。实验室的常见照明不会损害⼯作液。
7：将印记膜在⼯作液中孵育5分钟。
8：从⼯作液中取出印记膜，并置于⼀个塑料⽚或清洁的塑料纸（膜）中，用⼀张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间⼩⼼地压出⽓泡。
9：将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶⽚暗盒中，蛋白质⾯朝上，除适用于胶⽚曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。
注;胶⽚必须在曝光期间保持⼲燥，为获得最佳效果，采取⼀下措施：确保将多余的底物从膜和塑料纸上完全去除；在整个胶⽚处理期间，使用手套；切莫将印记膜置于已显影的胶⽚上，因为胶⽚上的化学物质会减弱信号。
10：将X光胶⽚置于膜的上⾯。建议第⼀次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是最强烈的。这⼀反应可以持续⼏个⼩时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使⽤磷光存储成像设备（如Bio-Rad的分⼦成像仪系统）或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。
警告：胶⽚与膜之间的任何移动可能在胶⽚上造成⼈为的⾮特异信号。
11：使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。
检测灵敏度
优化抗原和抗体的浓度。必须使用建议抗体稀释度，以保证阳性结果。建议的稀释度范围请参考其他所需材料。
一：将一抗从1mg/ml储备液稀释到0.2～1.0ug/ml或1:1.000～1：5.000稀释度
二：将二抗从1mg/ml储备液稀释到10～50ng/ml或1:20.000～1：100.000稀释度
三：将两种底物组份按1:1比例混合，制备底物工作液。
四：将印迹膜在Femto ECL & Dura ECL底物工作液中孵育5分钟。
五：吸出多余试剂。用清洁的塑料膜盖住该印迹膜。
六：使印迹膜在X光胶片上曝光。
1：将印记膜从蛋白转印设备中取出，加⼊合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟，同时振荡。以封闭膜上⾮特异性蛋白结合位点。
注意：使用在前文其他所需材料章节中建议的抗体稀释度是⾮常重要的。
2：将膜从封闭液中取出，与⼀抗⼯作液在温室孵育1小时，同时振荡；或在28℃孵育过夜，不振荡。
3：将⾜量的洗涤缓冲液加⾄膜上，保证缓冲液将膜完全覆盖。振荡孵育≥5分钟，更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。
注：孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。
使⽤在前⽂其他所需材料章节中建议的HRP标记⼆抗稀释度是⾮常重要的。
4：将HRP标记的⼆抗⼯作液与膜在温室孵育1小时，同时振荡。
5：重复步骤3，以除去未结合的HRP标记⼆抗。注：膜与HRP标记⼆抗孵育后必须进⾏彻底洗涤。
6：将A溶液与B液等⽐例混合，制备成⼯作液。每cm2膜使⽤0.01-0.1ml⼯作液。⼯作液可以在温室下稳定8小时。
注：暴露于⽇光或任何其他强光下可能损害⼯作液，为获得最佳结果，将此⼯作液保存在琥珀⾊瓶中，并避免长期暴露于任何强光。实验室的常见照明不会损害⼯作液。
7：将印记膜在⼯作液中孵育5分钟。
8：从⼯作液中取出印记膜，并置于⼀个塑料⽚或清洁的塑料纸（膜）中，用⼀张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间⼩⼼地压出⽓泡。
9：将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶⽚暗盒中，蛋白质⾯朝上，除适用于胶⽚曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。
注;胶⽚必须在曝光期间保持⼲燥，为获得最佳效果，采取⼀下措施：确保将多余的底物从膜和塑料纸上完全去除；在整个胶⽚处理期间，使用手套；切莫将印记膜置于已显影的胶⽚上，因为胶⽚上的化学物质会减弱信号。
10：将X光胶⽚置于膜的上⾯。建议第⼀次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是最强烈的。这⼀反应可以持续⼏个⼩时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使⽤磷光存储成像设备（如Bio-Rad的分⼦成像仪系统）或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。
警告：胶⽚与膜之间的任何移动可能在胶⽚上造成⼈为的⾮特异信号。
11：使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。
检测灵敏度
| 检测浓度 | 推荐一抗孵育浓度（ng/mL） | 推荐二体孵育浓度（ng/mL） |
| 小于飞克级<10-15g | 一抗浓度：2-100 | 二抗浓度：2-20 |
自备材料：
1：已完成转印的印迹膜：使用任何合适的电泳法分离蛋⽩质，并将这些蛋⽩质转移到硝酸纤维素膜上。也可使用其他类型的膜，但操作步骤可能需要进⾏优化。
2：稀释缓冲液：使⽤Tris或磷酸盐缓冲液。
3：洗涤缓冲液：将5mL 10%的Tween-20加⼊1.000mL稀释缓冲液（Tween-20的终浓度将为0.05%）。
4：封闭试剂：将0.5mL10%的Tween-20加⼊100mL的封闭缓冲液，选择⼀种与稀释缓冲液具有相同基本组分的封闭缓冲液。
5：⼀抗：选择⼀种⽬标蛋⽩质特异性抗体。使⽤稀释缓冲液制备该抗体的1mg/ml储备液。使⽤封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体⼯作液。稀释度介于1:1.000和1:5.000之间或抗体⼯作液浓度为0.2-1ug/ml.最佳稀释度取决于⼀抗和膜上的抗原量。
6：HRP标记的⼆抗：选择⼀种与⼆抗特异性结合的HRP标记⼆抗，使⽤稀释缓冲液制备该抗体的1mg/ml储备液。使⽤封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体⼯作液。稀释度介于1:20.000和1:100.000之间或抗体⼯作液浓度为10-50ug/ml。该浓度范围在使⽤链亲和素-HRP时也适⽤。⼆抗的最佳稀释度取决于HRP标记⼆抗和膜上的抗原量。
7：用于处理放射显影胶⽚的胶⽚暗盒、显影和定影试剂
8：用于孵育的旋转摇床。
2：稀释缓冲液：使⽤Tris或磷酸盐缓冲液。
3：洗涤缓冲液：将5mL 10%的Tween-20加⼊1.000mL稀释缓冲液（Tween-20的终浓度将为0.05%）。
4：封闭试剂：将0.5mL10%的Tween-20加⼊100mL的封闭缓冲液，选择⼀种与稀释缓冲液具有相同基本组分的封闭缓冲液。
5：⼀抗：选择⼀种⽬标蛋⽩质特异性抗体。使⽤稀释缓冲液制备该抗体的1mg/ml储备液。使⽤封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体⼯作液。稀释度介于1:1.000和1:5.000之间或抗体⼯作液浓度为0.2-1ug/ml.最佳稀释度取决于⼀抗和膜上的抗原量。
6：HRP标记的⼆抗：选择⼀种与⼆抗特异性结合的HRP标记⼆抗，使⽤稀释缓冲液制备该抗体的1mg/ml储备液。使⽤封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体⼯作液。稀释度介于1:20.000和1:100.000之间或抗体⼯作液浓度为10-50ug/ml。该浓度范围在使⽤链亲和素-HRP时也适⽤。⼆抗的最佳稀释度取决于HRP标记⼆抗和膜上的抗原量。
7：用于处理放射显影胶⽚的胶⽚暗盒、显影和定影试剂
8：用于孵育的旋转摇床。
保存条件：
2-8°C 一年
注意事项：
1：为获得最佳效果，必须优化该系统的全部组分，包括样品量、一抗和二抗浓度以及膜和封闭试剂的类型。由于该底物极其敏感，底物要求使用比大多数市售底物少得多的样品、一抗、二抗，通常再稀释浓度20-50倍。
2：使用该产品比使用沉淀比色HRP底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度，请进行一次系统的点印迹分析。
3：没有⼀种封闭试剂对所有系统⽽⾔都是最佳的，所以为每⼀个免疫印迹检测系统找到最合适的封闭缓冲液⾮常必需。封闭试剂有可能与抗体产⽣交叉反应，导致出现⾮特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性。当从⼀种底物转换为另⼀种底物时，有时会出现信号衰减或背景增加的现象，原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统。
4：使⽤亲和素/⽣物素检测系统时，避免使⽤⽜奶作为封闭试剂，因为⽜奶中含有不定量的内源性⽣物素，会导致⾼背景信号。
5：保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物⼯作液的使⽤体积，以确保在整个实验过程中印迹膜完全被液体覆盖，避免膜变⼲。增⼤封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使⽤量可以降低⾮特异性的信号。
6：为获得最佳效果，在孵育步骤请使⽤摇床。
7：将Tween20(终浓度0.05-0.1%)加⼊封闭缓冲液和稀释的抗体溶液，以降低⾮特异信号；⽤⾼品质的产品，如去污剂。它保存在安瓿瓶中，过氧化物和其他杂质含量很低。
8：不要使⽤叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。叠氮钠是HRP的抑制物
9：避免⼿与膜直接接触，实验过程应戴⼿套或使⽤⼲净的镊⼦。
10：所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械（如剪⼑）不得具有可见的锈迹。锈迹可能导致斑点形成和高背景。
11：底物⼯作液在室温下可稳定8小时。⽇光或任何其他强光下可能损害底物，为获得最佳结果，将底物⼯作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴露在任何强光下，短时间暴露于实验室常规照明不会损害该⼯作液。
2：使用该产品比使用沉淀比色HRP底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度，请进行一次系统的点印迹分析。
3：没有⼀种封闭试剂对所有系统⽽⾔都是最佳的，所以为每⼀个免疫印迹检测系统找到最合适的封闭缓冲液⾮常必需。封闭试剂有可能与抗体产⽣交叉反应，导致出现⾮特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性。当从⼀种底物转换为另⼀种底物时，有时会出现信号衰减或背景增加的现象，原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统。
4：使⽤亲和素/⽣物素检测系统时，避免使⽤⽜奶作为封闭试剂，因为⽜奶中含有不定量的内源性⽣物素，会导致⾼背景信号。
5：保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物⼯作液的使⽤体积，以确保在整个实验过程中印迹膜完全被液体覆盖，避免膜变⼲。增⼤封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使⽤量可以降低⾮特异性的信号。
6：为获得最佳效果，在孵育步骤请使⽤摇床。
7：将Tween20(终浓度0.05-0.1%)加⼊封闭缓冲液和稀释的抗体溶液，以降低⾮特异信号；⽤⾼品质的产品，如去污剂。它保存在安瓿瓶中，过氧化物和其他杂质含量很低。
8：不要使⽤叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。叠氮钠是HRP的抑制物
9：避免⼿与膜直接接触，实验过程应戴⼿套或使⽤⼲净的镊⼦。
10：所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械（如剪⼑）不得具有可见的锈迹。锈迹可能导致斑点形成和高背景。
11：底物⼯作液在室温下可稳定8小时。⽇光或任何其他强光下可能损害底物，为获得最佳结果，将底物⼯作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴露在任何强光下，短时间暴露于实验室常规照明不会损害该⼯作液。
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
参考文献 & 客户发表文献
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
