产品简介：
荧光染料PKH67适用于常规细胞膜标记，是一种可对体外和体内细胞示踪的绿色荧光染料，，通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞。PKH67对细胞毒性较小，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，有着强而稳定的绿色荧光。经PKH67标记的细胞可用于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染色的功能。在细胞分裂增殖过程中，PKH67的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。PKH67标记细胞的荧光非常均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均一。在细胞分裂增殖过程中，PKH67标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的一半，通过流式细胞仪根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂一次(1/2的荧光强度)，二次(1/4的荧光强度)，三次(1/8的荧光强度)，以及更多分裂次数的细胞。PKH67 可检测 分裂次数多达六次甚至更多。除了用于细胞增殖检测，PKH67 还可以用于细胞的体外盒体内示踪，标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况;或将标记的细 胞注入体内，可以有效的显示移植细胞在活体组织中的迁移及分化。PKH67标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。PKH67毒性较小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。
由于炭尾长度更长，内部研究已经证明PKH67比PKH2 由更少的细胞间转移。在采用PKH1和 PKH2进行的体内研究中，荧光强度都会缓慢损失。由于这是绿色细胞 linker 染料而非红色细胞 linker 染料出现的行为特征，因而PKH67会出现类似的性质。不分裂细胞的体外细胞膜留存和体内荧光半衰期的关联性揭示，PKH67的体内荧光半衰期为10-12 天。其他具有类似半衰期的绿色细胞 linker 染料已经被用于监测1-2 月内的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输，结果表明PKH67还可用于中等时长的体内跟踪研究。
染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞 示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的 PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。PKH67标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。
PKH67标记细胞呈绿色荧光，荧光波长:λex=490 nm, λem=502 nm。
由于炭尾长度更长，内部研究已经证明PKH67比PKH2 由更少的细胞间转移。在采用PKH1和 PKH2进行的体内研究中，荧光强度都会缓慢损失。由于这是绿色细胞 linker 染料而非红色细胞 linker 染料出现的行为特征，因而PKH67会出现类似的性质。不分裂细胞的体外细胞膜留存和体内荧光半衰期的关联性揭示，PKH67的体内荧光半衰期为10-12 天。其他具有类似半衰期的绿色细胞 linker 染料已经被用于监测1-2 月内的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输，结果表明PKH67还可用于中等时长的体内跟踪研究。
染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞 示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的 PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。PKH67标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。
PKH67标记细胞呈绿色荧光，荧光波长:λex=490 nm, λem=502 nm。
操作步骤：
一：染色液制备
1：从冰箱中取出PKH67试剂，静置几分钟至室温，或者37°C水浴片刻后，离心盛放PKH67 的管子，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落入管底后才能开盖。
2：根据需要检测的细胞样品数，用稀释液将探针10倍稀释，再用合适的溶液(如:无血清培养基，HBSS或PBS)将PKH67母液25倍稀释，配制成染色工作液。最佳工作液浓度请根据不同细胞和自身的实验体系来调整。一般细胞使用按试剂盒中的母液 的终浓度250倍稀释即可，有些细胞可能需要适当增加浓度。
二：细胞染色
1：将制备好的待测细胞用100μl染色工作液重悬，至细胞浓度大约107/ml。也可以进行原位染色，染色液足够覆盖细胞即可。
2：在2-8°C培养细胞15-30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。建议待标记细胞在染色工作液中于37°C孵育5min，再于4°C孵育15min。低温孵育可降低细胞对染料的内吞作用，有助于染料对质膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。
3：离心后去上清，收集细胞，用PBS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入PBS或无血清培养基重悬细胞。
4：取500μl 细胞悬液，用流式细胞仪检测。Ex/Em=490/502nm。
5：随后还可按照细胞的正常培养方法进行培养。
6：可以在荧光显微镜下直接观察标记效果，也可以在培养适当时间后再用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于其他特定实验目的的细胞荧光示踪。
三：外泌体染色
外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的⼀种，与癌症的恶化与转移密切相关，外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄⼊外泌体时的示踪技术⾮常重要。PKH26和PKH67作为新型荧光染料，可满⾜多重染⾊在内的各种实验需求。
外泌体蛋⽩定量：取适量外泌体进⾏BCA蛋⽩浓度测定以确定外泌体蛋⽩量。
配制PKH⼯作液：⽤稀释液C将PKH稀释10倍，配制成⼯作液（现配现⽤）
准备细胞：将细胞接种到培养皿中，并在37℃ 5% CO2培养箱中预培养一段时间 。
Exosome 染⾊
染⾊时所需的 Exosome 的量：表1
注意：
上述外泌体的量是使⽤超速离⼼法获得的外泌体的⼤概的量。
染⾊所需的外泌体的量因外泌体纯化条件和细胞种类⽽异。第⼀次染⾊时，请预先摸索外泌体的最佳⽤量。
通过聚合物沉淀获得的外泌体会受到剩余聚合物的影响，因此⽆法⽤本试剂盒染⾊。
1：吸取 100 uL悬浮于 PBS 中的外泌体⾄微型管中。
2：吸取 2 uLPKH⼯作液 ⾄步骤 1 的溶液中，并⽤涡旋混合器充分混合。
3：在 37°C 下培养 30 min。
4：将全部溶液转移⾄过滤管中。
5：在室温下以 3,000 x g 离⼼ 5 min。
6：向过滤管中加⼊ 100 uL PBS。
7：在室温下 3,000 x g 离⼼ 5 min。
8：再次重复步骤 7 和 8。
9：在室温下以 3,000 x g 再次离⼼ 5 min，以使剩余溶液滤净。
注意：当离心速度>3,000 x g 时，外泌体也会通过滤膜，导致回收量降低。如果溶液仍然存在，请重复离心直至所有溶液滤净。
10：吸取 50 uLPBS ⾄过滤管中，注意枪头不要碰触到未反应的染料，轻轻吹打，并将收集的染⾊后外泌体转移到新微型管中。
注意：由于未反应的染料也保留在滤膜上，枪头如果直接接残留的染料可能会造成污染。
向细胞中添加外泌体
11：去除培养基，并⽤ PBS 洗涤 1 次。
12：去除 PBS，然后加⼊新鲜的含⾎清培养基。
13：吸取 1-50 uL染⾊的外泌体⾄细胞中，并在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养 1-24 h。
14：去除上清液，⽤ PBS 洗涤2次。
15：去除 PBS，加⼊新鲜的含⾎清培养基，⽤荧光显微镜观察。
⽤ HeLa 细胞观察荧光强度随外泌体添加量和培养时间的变化
1：将 HeLa 细胞（1.25×104 个细胞/孔）接种在μ-Slide 8 Well Plate上，并在37℃ 5% CO2 培养箱中过夜培养。
2：去除培养基，⽤ PBS 洗涤1次，并加⼊200 uL新鲜的含 10% FBS的DMEM培养基。
3：将已⽤ ExoSparkler 外泌体膜染⾊试剂盒染⾊并纯化过的外泌体（5 /10 μg 蛋⽩，粒⼦数为 50/100x108个），加⼊到含有Hela细胞的孔中。
4：在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养2或4 h。
5：去除培养基，并⽤ PBS 洗涤2次。
6：去除 PBS，加⼊ 200 uL新鲜的含10% FBS 的 DMEM 培养基，⽤荧光显微镜观察。
注意：用超速离心从悬浮细胞HEK293的上清液中纯化外泌体并使用。
注意：用 BCA法测量蛋白质的量，并且通过Nanoparticles Tracking Analysis (NTA)测量粒子数。
1：从冰箱中取出PKH67试剂，静置几分钟至室温，或者37°C水浴片刻后，离心盛放PKH67 的管子，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落入管底后才能开盖。
2：根据需要检测的细胞样品数，用稀释液将探针10倍稀释，再用合适的溶液(如:无血清培养基，HBSS或PBS)将PKH67母液25倍稀释，配制成染色工作液。最佳工作液浓度请根据不同细胞和自身的实验体系来调整。一般细胞使用按试剂盒中的母液 的终浓度250倍稀释即可，有些细胞可能需要适当增加浓度。
二：细胞染色
1：将制备好的待测细胞用100μl染色工作液重悬，至细胞浓度大约107/ml。也可以进行原位染色，染色液足够覆盖细胞即可。
2：在2-8°C培养细胞15-30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。建议待标记细胞在染色工作液中于37°C孵育5min，再于4°C孵育15min。低温孵育可降低细胞对染料的内吞作用，有助于染料对质膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。
3：离心后去上清，收集细胞，用PBS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入PBS或无血清培养基重悬细胞。
4：取500μl 细胞悬液，用流式细胞仪检测。Ex/Em=490/502nm。
5：随后还可按照细胞的正常培养方法进行培养。
6：可以在荧光显微镜下直接观察标记效果，也可以在培养适当时间后再用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于其他特定实验目的的细胞荧光示踪。
三：外泌体染色
外泌体作为细胞外囊泡（Extracellular vesicle; EV）的⼀种，与癌症的恶化与转移密切相关，外泌体相关的研究也逐渐成为了关注的热点。为了研究通过外泌体的细胞间通信，细胞摄⼊外泌体时的示踪技术⾮常重要。PKH26和PKH67作为新型荧光染料，可满⾜多重染⾊在内的各种实验需求。
外泌体蛋⽩定量：取适量外泌体进⾏BCA蛋⽩浓度测定以确定外泌体蛋⽩量。
配制PKH⼯作液：⽤稀释液C将PKH稀释10倍，配制成⼯作液（现配现⽤）
准备细胞：将细胞接种到培养皿中，并在37℃ 5% CO2培养箱中预培养一段时间 。
Exosome 染⾊
染⾊时所需的 Exosome 的量：表1
注意：
上述外泌体的量是使⽤超速离⼼法获得的外泌体的⼤概的量。
染⾊所需的外泌体的量因外泌体纯化条件和细胞种类⽽异。第⼀次染⾊时，请预先摸索外泌体的最佳⽤量。
通过聚合物沉淀获得的外泌体会受到剩余聚合物的影响，因此⽆法⽤本试剂盒染⾊。
1：吸取 100 uL悬浮于 PBS 中的外泌体⾄微型管中。
2：吸取 2 uLPKH⼯作液 ⾄步骤 1 的溶液中，并⽤涡旋混合器充分混合。
3：在 37°C 下培养 30 min。
4：将全部溶液转移⾄过滤管中。
5：在室温下以 3,000 x g 离⼼ 5 min。
6：向过滤管中加⼊ 100 uL PBS。
7：在室温下 3,000 x g 离⼼ 5 min。
8：再次重复步骤 7 和 8。
9：在室温下以 3,000 x g 再次离⼼ 5 min，以使剩余溶液滤净。
注意：当离心速度>3,000 x g 时，外泌体也会通过滤膜，导致回收量降低。如果溶液仍然存在，请重复离心直至所有溶液滤净。
10：吸取 50 uLPBS ⾄过滤管中，注意枪头不要碰触到未反应的染料，轻轻吹打，并将收集的染⾊后外泌体转移到新微型管中。
注意：由于未反应的染料也保留在滤膜上，枪头如果直接接残留的染料可能会造成污染。
向细胞中添加外泌体
11：去除培养基，并⽤ PBS 洗涤 1 次。
12：去除 PBS，然后加⼊新鲜的含⾎清培养基。
13：吸取 1-50 uL染⾊的外泌体⾄细胞中，并在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养 1-24 h。
14：去除上清液，⽤ PBS 洗涤2次。
15：去除 PBS，加⼊新鲜的含⾎清培养基，⽤荧光显微镜观察。
⽤ HeLa 细胞观察荧光强度随外泌体添加量和培养时间的变化
1：将 HeLa 细胞（1.25×104 个细胞/孔）接种在μ-Slide 8 Well Plate上，并在37℃ 5% CO2 培养箱中过夜培养。
2：去除培养基，⽤ PBS 洗涤1次，并加⼊200 uL新鲜的含 10% FBS的DMEM培养基。
3：将已⽤ ExoSparkler 外泌体膜染⾊试剂盒染⾊并纯化过的外泌体（5 /10 μg 蛋⽩，粒⼦数为 50/100x108个），加⼊到含有Hela细胞的孔中。
4：在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养2或4 h。
5：去除培养基，并⽤ PBS 洗涤2次。
6：去除 PBS，加⼊ 200 uL新鲜的含10% FBS 的 DMEM 培养基，⽤荧光显微镜观察。
注意：用超速离心从悬浮细胞HEK293的上清液中纯化外泌体并使用。
注意：用 BCA法测量蛋白质的量，并且通过Nanoparticles Tracking Analysis (NTA)测量粒子数。
| 表1 | |
| 外泌体蛋⽩量 | 10 - 200μg |
| PKH⼯作液⽤量 | 50uL |
组分：
| 组分名称 | 规格(0.1mL) |
| PKH67 染料 | 0.1mL |
| 稀释液 | 10mL |
保存条件：
-20°C，一年。
注意事项：
1：染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。
2：配制的PKH67母液极易水解，建议分装保存，≦-20°C冷冻干燥保存。
3：PKH67工作液应现配现用，不能提前配制，因为PKH67 吸水会分解，影响染色效果。
4：PKH67易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可 的时间范围内的。
5：PKH67荧光染色剂为DMSO溶液，在4°C、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，从冰箱取出后恢 复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以37°C水浴片刻至全部融解后使用。
6：不同的细胞种类标记后可以示踪的代次或时间差异较大，请根据实际情况或参考文献进行检测。
2：配制的PKH67母液极易水解，建议分装保存，≦-20°C冷冻干燥保存。
3：PKH67工作液应现配现用，不能提前配制，因为PKH67 吸水会分解，影响染色效果。
4：PKH67易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可 的时间范围内的。
5：PKH67荧光染色剂为DMSO溶液，在4°C、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，从冰箱取出后恢 复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以37°C水浴片刻至全部融解后使用。
6：不同的细胞种类标记后可以示踪的代次或时间差异较大，请根据实际情况或参考文献进行检测。
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
参考文献 & 客户发表文献
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
