产品简介：
水溶性四唑（2-（2-甲氧基-4硝基苯）-3-(4-硝基苯)-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐，psaitong产品编号:W10010），是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料(formazan,下图)， 这种甲臜染料直接溶解在培养基中。水溶性四唑被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜。细胞增殖越多越快，则培养基的颜色越深；细胞毒性越大，反之，则颜色越浅。对于同样的细胞，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。正是利用这一特性开发的CCK-8试剂盒直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
CCK-8试剂盒可以用于生物活性因子的活性检测，抗肿瘤药物的筛选，细胞增值的测定，细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便，试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即开即用，无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶标仪上检测，适合大规模，高通量的样品检测。
CCK-8试剂盒可以用于生物活性因子的活性检测，抗肿瘤药物的筛选，细胞增值的测定，细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便，试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即开即用，无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶标仪上检测，适合大规模，高通量的样品检测。
操作步骤：
一、通用操作步骤
1. 在96孔板每孔加入100uL细胞悬液。
2.在培养箱中预培养细胞。
3.向培养板中加入药物(如果不加药物，直接进行第五步操作)。
4.在培养箱中培养一段时间。
5. 向每孔加入10 μL的CCK溶液。
6. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时(根据具体实验优化)。
7. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
二、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2、按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标 (Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间)
三、细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37 °C,5% CO2的条件下）。
2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
四、细胞增殖-毒性检测
使用方法（以96孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排）：
1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl 2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行培养（在37 °C，5%CO2,，的条件下）预培养24小时。
2、向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时）。
4、每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
5、在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。
7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
8、注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算：
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
细胞增殖分析：
设备：培养箱;酶标仪;单枪或排枪
制备细胞悬液
↓
接种到96孔培养板
↓
37℃培养箱中培养(注1) ：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,不需要贴壁的话，可以省去这个步骤。
↓
加入10ul的CCK-8：由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
↓
培养1-4小时：
1、细胞的种类不一样，形成的Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。，特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
2、如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以帮助混匀。
↓
测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。
详图请见说明书
细胞毒性分析：
设备：培养箱;酶标仪;单枪或排枪
制备细胞悬液
↓
接种到96孔培养板
↓
37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，不需要贴壁的话，可以省去这个步骤。
↓
加入不同浓度的毒性物质
↓
加入10ul的CCK-8：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性
↓
培养1-4小时
由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔 壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混 匀。
细胞的种类不一样，形成的Formazan 的量也不一样。如果 显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血 液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间 （5-6小时）。
↓
测定450nm吸光度：如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以混匀。
建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm, 参比波长 600-650nm。
详图请见说明书
1. 在96孔板每孔加入100uL细胞悬液。
2.在培养箱中预培养细胞。
3.向培养板中加入药物(如果不加药物，直接进行第五步操作)。
4.在培养箱中培养一段时间。
5. 向每孔加入10 μL的CCK溶液。
6. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时(根据具体实验优化)。
7. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
二、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2、按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标 (Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间)
三、细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37 °C,5% CO2的条件下）。
2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
四、细胞增殖-毒性检测
使用方法（以96孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排）：
1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl 2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行培养（在37 °C，5%CO2,，的条件下）预培养24小时。
2、向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时）。
4、每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
5、在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。
7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
8、注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算：
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
细胞增殖分析：
设备：培养箱;酶标仪;单枪或排枪
制备细胞悬液
↓
接种到96孔培养板
↓
37℃培养箱中培养(注1) ：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,不需要贴壁的话，可以省去这个步骤。
↓
加入10ul的CCK-8：由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
↓
培养1-4小时：
1、细胞的种类不一样，形成的Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。，特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
2、如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以帮助混匀。
↓
测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。
详图请见说明书
细胞毒性分析：
设备：培养箱;酶标仪;单枪或排枪
制备细胞悬液
↓
接种到96孔培养板
↓
37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，不需要贴壁的话，可以省去这个步骤。
↓
加入不同浓度的毒性物质
↓
加入10ul的CCK-8：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性
↓
培养1-4小时
由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔 壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混 匀。
细胞的种类不一样，形成的Formazan 的量也不一样。如果 显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血 液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间 （5-6小时）。
↓
测定450nm吸光度：如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以混匀。
建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm, 参比波长 600-650nm。
详图请见说明书
常见问题：
Q1.设定参比波长的目的是什么？必须要设定吗？
A1.不一定要设定。 CCK-8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
Q2.如何设定空白对照？
A2.可以在不含细胞，含有药物的培养基中加CCK-8,测定450nm的吸光度最为空白对照
Q3.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
A3.有时会有影响。如果药物具有氧化还原性，会和CCK-8发生反应，吸光度发生变化。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度与不含药物的培养基（加CCK-8）的吸光度相比有明显变化，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
Q4.不更换培养基加CCK-8试剂，有没有问题？
A4.一般没有问题。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，可能会产生误差，必须更换其他培养基。我以下培养基会影响测定：培养基IMDM的空白吸收1.0；培养基McCoy/s的空白吸收0.3。
Q5.哪些物质会影响CCK-8的测定？
A5.当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增加O.D.值；在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，减小O.D.值；在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可；血清不影响测定。
Q6.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
A6.一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.
Q7如何减少由于CCK-8试剂在枪头或者孔壁上的残留所带来的误差 ？
A7.可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
Q8.每次测定的O.D.D值不一样，是什么原因？如何解决？
A8.可能会有以下几个原因：
1.当在培养箱中培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，导致培养基的体积不一样，从而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000-100000个/孔范围内摸索条件。
Q9.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
A9. 有以下几种方法：注意: 反应停止后, 应在24小时内测定。
1)每孔加10ul0.1M HCI溶液。
2)在显色反应后，将培养板放入4℃冰箱内。
3)每孔加10ul 1%(w/v)的SDS（十二烷基磺酸钠）溶液。
Q10.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
A10.缩短加入CCK-8后的培养时间。
Q11.必须预培养细胞吗？
A11.不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞的预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有研究人员不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
Q12.如果加入的药物中有金属，是否会有影响？
A12.金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。
Q13.CCK-8的保质期有多久？
A13.CCK-8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存，我们推荐在-20℃储藏。正常的CCK-8颜色为浅红粉色，如有明显颜色变化，则CCK-8的质量有可能发生变化。CCK-8若反复冻融有可能会增加空白吸收，从而影响检测结果，若短时间频繁使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
Q14.预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
A14.一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精确计数细胞，可以预培养后去培养基用血球计数盘进行计数。
Q15.CCK-8是否对细胞进行染色？
A15.CCK-8不对细胞进行染色。培养基中的CCK-8并不进入细胞内染色细胞，而是在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲臜染料，是一个显色反应。显色反应后，更换新的培养基，可以继续培养细胞。
Q16.CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
A16.不同细胞的脱氢酶活性不一样，显色程度不一样，灵敏度也不一样。
Q17.悬浮细胞和贴壁细胞在接种数量上有何区别？
A17.大部分悬浮细胞相比贴壁细胞比较难显色，O.D.值偏低，一般需要增加细胞接种数量或延长加入CCK-8后的培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
Q18.应该每次做标准曲线吗？
A18.建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
Q19.有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A19.不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则实际测定的活细胞数量将会比真实值高，不能真实反应活细胞数量，建议采用别的方法测定。
Q20.CCK-8是什么颜色？
A20.应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
Q21.导入基因后，是否用CCK-8来检测活细胞？
A21.可以
Q22.在pH5的培养基中培养细胞，是否可以用CCK-8试剂检测？
A22.理论上可以的，但是需要做标准曲线进一步确定。
Q23.O.D.值在什么范围比较合适？
A23.一般情况下O.D.值在0.1-2.0范围内都可以，在1.0附近较好。
Q24.细菌是否会和CCK-8试剂发生反应？
A24.CCK-8不会和细菌发生显色反应。细菌防御系统强，不会发生还原反应
Q25.CCK-8试剂用于测定活细胞的数量，对于增殖期的细胞和静止期的细胞，有何影响？
A25.一般情况下CCK-8试剂用于检测对数生长期的细胞。如果静止期细胞的脱氢酶活性和增殖期的细胞的脱氢酶活性有很大的 不同的话，则两者会有很大的差别。
Q26.如果O.D.值太低，可以采取什么办法？
A26.两个办法：1)适当增加细胞数量; 2)延长加入CCK-8后的反应时间。
Q27.在做药物毒性实验时，加入CCK-8培养一段时间后，检测时颜色没有变化，样品和空白O.D.值一样，是何原因？
A27.可能因素有2个：药物的浓度太高，细胞全部被杀死；如果药物有氧化性，则会抑制CCK-8试剂的显色反应，可以采取先更换培养基清洗掉药物，然后再加CCK-8试剂进行检测的方法。
Q28.如何避免细胞聚团现象？
A28. 1) 消化时间长一些。2) 细胞培养好后，手摇或设备摇匀。3)用枪头反复吹打，但要避免产生气泡。
Q29.做悬浮细胞的实验时，检测几天比较合适？
A29.由于不更换培养基长时间的培养，培养基中的氧气和营养会流失，会影响细胞的状态。建议培养4-5天左右，但要确定细胞数量是否已经达到饱和？如果需要长时间培养，因为容易蒸发，建议培养板的边缘孔不加细胞。
Q30.如何制作标准曲线？
A30.先取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中，然后用培养基一次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液，细胞培养一段时间后加CCK-8试剂，培养一段时间，等颜色发生明显变化后，用酶标仪进行测定，以细胞数量为X轴，O.D.值为Y轴，就可以做成一条标准曲线。
Q31.细胞数量太多会有什么结果？
A31.贴壁细胞如果接种太多，细胞在培养过程中容易长满而产生互相挤压的现象，导致细胞状态不好或者死亡。另外细胞接种太多容易产生O.D.值过高（甚至于超过仪器的检测范围）的情况。
Q32.BrdU法和CCK-8法有何区别？
A32.CCK-8法师通过检测对数生长期的细胞内的脱氢酶来反映细胞的活性，而BrdU法是检测细胞的DNA合成。CCK-8法只需要加入知己，通过比色法就可以检测，而BrdU法不仅要加入试剂，而且要固定细胞，通过抗原抗体反应之后用发光法来检测。两者的原理是完全不同的。如果只是检测细胞增殖的话，那么CCK-8的方法是比较简单的。
Q33.在做药物毒性实验时，药物对细胞有抑制作用，但检测结果却是O.D.值升高，为什么？
A33.很可能药物和CCK-8试剂发生了反应，可以做一个只加药物的空白对照，如果O.D.值确实比正常的空白对照O.D.值高很多，则说明药物和CCK-8试剂发生了反应。可以通过更换培养基清洗掉药物的办法解决。
Q34.加入CCK-8试剂后，为什么在不同时间检测的值不一样（例如在3小时和在3.5小时）？
A34.由于CCK-8试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应，随着时间的增加，O.D.值也会不断增加，颜色会不断加深，但细胞数量却没有什么太大变化。一般情况下建议在确定最佳的实验条件（合适的时间、合适的O.D.值）后，把加入CCK-8试剂后的培养时间固定下来，以后在同样的培养时间点进行检测。
Q35.组内数据差异比较大或组间数据杂乱，没有规律，是何原因？
A35.原因有可能是CCK-8试剂在移液枪的枪头上或培养板的孔壁上残留，加入时最好快速加入以避免残留，可以用培养基稀释CCK-8试剂的办法来降低误差：用培养基稀释CCK-8试剂1倍，混匀后每孔加20ul使用。
Q36.用CCK-8试剂做细胞毒性检测时：1）贴壁细胞预培养多长时间合适？2）预培养过程中细胞分裂，如何计算细胞数量？3）如果预培养时间太长，会有什么结果？
A36. 一般情况下建议贴壁细胞预培养的时间为24h. 如果只计算药物的LD50值的话,可不必考虑预培养过程中的细胞分裂问题,但要做一个加细胞的对照(该值为最大值)。 如果预培养时间太长，有可能细胞会增长过多，达到饱和状态，O.D.值将会很高，甚至会超过仪器的检测范围。
Q37.在实验中加入刺激细胞增长的因子，但是细胞数量却没有增加（或者吸光值没有上升），为什么？
A37.首先用显微镜观察一下，确定细胞数量是否增加？然后才考虑其他的因素（如果加入的刺激因子和CCK-8发生反应的话，吸光值不变这种可能性是非常低的）。如果显微镜下观察细胞数量确实增加了，则请检查加入的药物是否具有氧化性？有可能抑制了CCK-8试剂的反应。方法是：在有细胞的培养基中做1个加药物和不加药物的对比，然后分别加入CCK-8试剂进行检测，如果不加药物的O.D.值比加药物的O.D.值高，则说明药物确实具有氧化性，产生了干扰。
A1.不一定要设定。 CCK-8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
Q2.如何设定空白对照？
A2.可以在不含细胞，含有药物的培养基中加CCK-8,测定450nm的吸光度最为空白对照
Q3.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
A3.有时会有影响。如果药物具有氧化还原性，会和CCK-8发生反应，吸光度发生变化。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度与不含药物的培养基（加CCK-8）的吸光度相比有明显变化，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
Q4.不更换培养基加CCK-8试剂，有没有问题？
A4.一般没有问题。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，可能会产生误差，必须更换其他培养基。我以下培养基会影响测定：培养基IMDM的空白吸收1.0；培养基McCoy/s的空白吸收0.3。
Q5.哪些物质会影响CCK-8的测定？
A5.当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增加O.D.值；在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，减小O.D.值；在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可；血清不影响测定。
Q6.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？
A6.一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.
Q7如何减少由于CCK-8试剂在枪头或者孔壁上的残留所带来的误差 ？
A7.可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
Q8.每次测定的O.D.D值不一样，是什么原因？如何解决？
A8.可能会有以下几个原因：
1.当在培养箱中培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，导致培养基的体积不一样，从而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000-100000个/孔范围内摸索条件。
Q9.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？
A9. 有以下几种方法：注意: 反应停止后, 应在24小时内测定。
1)每孔加10ul0.1M HCI溶液。
2)在显色反应后，将培养板放入4℃冰箱内。
3)每孔加10ul 1%(w/v)的SDS（十二烷基磺酸钠）溶液。
Q10.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
A10.缩短加入CCK-8后的培养时间。
Q11.必须预培养细胞吗？
A11.不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞的预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有研究人员不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
Q12.如果加入的药物中有金属，是否会有影响？
A12.金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。
Q13.CCK-8的保质期有多久？
A13.CCK-8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存，我们推荐在-20℃储藏。正常的CCK-8颜色为浅红粉色，如有明显颜色变化，则CCK-8的质量有可能发生变化。CCK-8若反复冻融有可能会增加空白吸收，从而影响检测结果，若短时间频繁使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
Q14.预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
A14.一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精确计数细胞，可以预培养后去培养基用血球计数盘进行计数。
Q15.CCK-8是否对细胞进行染色？
A15.CCK-8不对细胞进行染色。培养基中的CCK-8并不进入细胞内染色细胞，而是在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲臜染料，是一个显色反应。显色反应后，更换新的培养基，可以继续培养细胞。
Q16.CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
A16.不同细胞的脱氢酶活性不一样，显色程度不一样，灵敏度也不一样。
Q17.悬浮细胞和贴壁细胞在接种数量上有何区别？
A17.大部分悬浮细胞相比贴壁细胞比较难显色，O.D.值偏低，一般需要增加细胞接种数量或延长加入CCK-8后的培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
Q18.应该每次做标准曲线吗？
A18.建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
Q19.有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A19.不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则实际测定的活细胞数量将会比真实值高，不能真实反应活细胞数量，建议采用别的方法测定。
Q20.CCK-8是什么颜色？
A20.应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
Q21.导入基因后，是否用CCK-8来检测活细胞？
A21.可以
Q22.在pH5的培养基中培养细胞，是否可以用CCK-8试剂检测？
A22.理论上可以的，但是需要做标准曲线进一步确定。
Q23.O.D.值在什么范围比较合适？
A23.一般情况下O.D.值在0.1-2.0范围内都可以，在1.0附近较好。
Q24.细菌是否会和CCK-8试剂发生反应？
A24.CCK-8不会和细菌发生显色反应。细菌防御系统强，不会发生还原反应
Q25.CCK-8试剂用于测定活细胞的数量，对于增殖期的细胞和静止期的细胞，有何影响？
A25.一般情况下CCK-8试剂用于检测对数生长期的细胞。如果静止期细胞的脱氢酶活性和增殖期的细胞的脱氢酶活性有很大的 不同的话，则两者会有很大的差别。
Q26.如果O.D.值太低，可以采取什么办法？
A26.两个办法：1)适当增加细胞数量; 2)延长加入CCK-8后的反应时间。
Q27.在做药物毒性实验时，加入CCK-8培养一段时间后，检测时颜色没有变化，样品和空白O.D.值一样，是何原因？
A27.可能因素有2个：药物的浓度太高，细胞全部被杀死；如果药物有氧化性，则会抑制CCK-8试剂的显色反应，可以采取先更换培养基清洗掉药物，然后再加CCK-8试剂进行检测的方法。
Q28.如何避免细胞聚团现象？
A28. 1) 消化时间长一些。2) 细胞培养好后，手摇或设备摇匀。3)用枪头反复吹打，但要避免产生气泡。
Q29.做悬浮细胞的实验时，检测几天比较合适？
A29.由于不更换培养基长时间的培养，培养基中的氧气和营养会流失，会影响细胞的状态。建议培养4-5天左右，但要确定细胞数量是否已经达到饱和？如果需要长时间培养，因为容易蒸发，建议培养板的边缘孔不加细胞。
Q30.如何制作标准曲线？
A30.先取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中，然后用培养基一次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液，细胞培养一段时间后加CCK-8试剂，培养一段时间，等颜色发生明显变化后，用酶标仪进行测定，以细胞数量为X轴，O.D.值为Y轴，就可以做成一条标准曲线。
Q31.细胞数量太多会有什么结果？
A31.贴壁细胞如果接种太多，细胞在培养过程中容易长满而产生互相挤压的现象，导致细胞状态不好或者死亡。另外细胞接种太多容易产生O.D.值过高（甚至于超过仪器的检测范围）的情况。
Q32.BrdU法和CCK-8法有何区别？
A32.CCK-8法师通过检测对数生长期的细胞内的脱氢酶来反映细胞的活性，而BrdU法是检测细胞的DNA合成。CCK-8法只需要加入知己，通过比色法就可以检测，而BrdU法不仅要加入试剂，而且要固定细胞，通过抗原抗体反应之后用发光法来检测。两者的原理是完全不同的。如果只是检测细胞增殖的话，那么CCK-8的方法是比较简单的。
Q33.在做药物毒性实验时，药物对细胞有抑制作用，但检测结果却是O.D.值升高，为什么？
A33.很可能药物和CCK-8试剂发生了反应，可以做一个只加药物的空白对照，如果O.D.值确实比正常的空白对照O.D.值高很多，则说明药物和CCK-8试剂发生了反应。可以通过更换培养基清洗掉药物的办法解决。
Q34.加入CCK-8试剂后，为什么在不同时间检测的值不一样（例如在3小时和在3.5小时）？
A34.由于CCK-8试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应，随着时间的增加，O.D.值也会不断增加，颜色会不断加深，但细胞数量却没有什么太大变化。一般情况下建议在确定最佳的实验条件（合适的时间、合适的O.D.值）后，把加入CCK-8试剂后的培养时间固定下来，以后在同样的培养时间点进行检测。
Q35.组内数据差异比较大或组间数据杂乱，没有规律，是何原因？
A35.原因有可能是CCK-8试剂在移液枪的枪头上或培养板的孔壁上残留，加入时最好快速加入以避免残留，可以用培养基稀释CCK-8试剂的办法来降低误差：用培养基稀释CCK-8试剂1倍，混匀后每孔加20ul使用。
Q36.用CCK-8试剂做细胞毒性检测时：1）贴壁细胞预培养多长时间合适？2）预培养过程中细胞分裂，如何计算细胞数量？3）如果预培养时间太长，会有什么结果？
A36. 一般情况下建议贴壁细胞预培养的时间为24h. 如果只计算药物的LD50值的话,可不必考虑预培养过程中的细胞分裂问题,但要做一个加细胞的对照(该值为最大值)。 如果预培养时间太长，有可能细胞会增长过多，达到饱和状态，O.D.值将会很高，甚至会超过仪器的检测范围。
Q37.在实验中加入刺激细胞增长的因子，但是细胞数量却没有增加（或者吸光值没有上升），为什么？
A37.首先用显微镜观察一下，确定细胞数量是否增加？然后才考虑其他的因素（如果加入的刺激因子和CCK-8发生反应的话，吸光值不变这种可能性是非常低的）。如果显微镜下观察细胞数量确实增加了，则请检查加入的药物是否具有氧化性？有可能抑制了CCK-8试剂的反应。方法是：在有细胞的培养基中做1个加药物和不加药物的对比，然后分别加入CCK-8试剂进行检测，如果不加药物的O.D.值比加药物的O.D.值高，则说明药物确实具有氧化性，产生了干扰。
保存条件：
-20℃ 避光保存,两年,避免反复冻融。
注意事项：
1、由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
2、CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
3、建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
4、建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要查到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰OD值读数。
5、当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μl培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔，（100μl培养基），且培养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
6、加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或PH值变化。建议换用新鲜的培养基。
7、如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
8、酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2、CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
3、建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
4、建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要查到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰OD值读数。
5、当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μl培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔，（100μl培养基），且培养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
6、加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或PH值变化。建议换用新鲜的培养基。
7、如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
8、酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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参考文献 & 客户发表文献
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质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
