肝组织中核酸的分离与鉴定
2020-05-21
[实验目的]
1.掌握核酸的分子组成。
2.熟悉核酸的分离及鉴定方法。
[实验原理]
组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。 核蛋白被三氯乙酸沉淀后，用10%NaCl溶液提取核酸的钠盐，再加人乙醇，可使核酸钠沉淀析出。
RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、碱基(嘌呤和嘧啶)和戊糖(RNA含核糖，DNA 含脱氧核糖)此三类化合物可用下述方法鉴定:
(1)磷酸与钼酸铵作用产生磷钼酸，后者在还原剂氨蔡酚磺酸作用下形成蓝色的铜蓝
(2)嘌呤碱与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。
(3)核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糖醛，后者和3，5-二羟甲苯缩合而成绿色化合物。
脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
[实验步骤]
1.制备匀浆
将小白鼠1只拉断脊椎致死，剖腹取出全部肝组织，用清水冲净血污后，用滤纸吸干，剪刀 剪碎，再加0.9%NaCl溶液2 mL于研钵中，制成匀浆。
2.分离提取
取全部匀浆于离心管(或小试管)内;加2%三氯乙酸2 mL,用玻璃棒搅匀，静置3 min; 以3000 r/min转速离心3 min,弃去上清液，于沉淀中加人10%NaCl溶液2 mL,充分混匀，置沸水 浴中加热8 min,用玻璃棒边加热边搅拌(防止试管底破裂)，使之充分生成核酸钠化合物，冷却，以3000 r/min转速离心3 min。将上清液倒人另一试管内，逐滴加入95%冷乙醇2 mL,边加边搅拌， 待析出白色沉淀。静止5 min后，再以3000 r/min转速离心5 min,倾去上清液后沉淀备用。
3.核酸水解
于上述沉淀(核酸钠)中加人5%H2SO.4 mL。用玻璃棒搅匀，在沸水浴中加热10 min,即 得核酸水解液。
4. RNA与DNA成分的鉴定
嚯呤碱的鉴定:取中试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加人下列各试剂。
加入AgNO3后，置沸水浴中5 min,观察两管颜色有何变化。
磷酸的鉴定:取长试管2支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。
充分混匀，放置3 min,再置于沸水浴内加热3 min,比较两管颜色。
核糖的鉴定:取长试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加下列各试剂。
将2支试管放入沸水浴内加热5 min,比较两管颜色。
脱氧核糖的鉴定:取长试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加下列各试剂。
将2支试管同时放人德水浴中，s min后观察两管颜色差别。
[试剂与器材]
1.试剂
(1)2%三氧乙酸溶液。
(2) 95%乙醇溶液。
(3) 0.9%NaCl溶液。
(4) 10%NaCl溶液。
(5) 5% H2SO4溶液。
(6) 5% AgNO3溶液。
(7）钼酸铵试剂:在20 mL水中溶解25g钼酸铵，加5mol/L H2SO4溶液30 mL.用水稀释至100 mL.此试剂可在冰箱中保存30天。
(8)氨(基)奈酚磺酸:市售氨(基)秦酚磺酸( 1.2.4-aminonaphthal-sulfonie acid)为暗红色；可纯炼如下:在100 mL热水(90℃)中溶解15g NaHSO4及1g Na2SO4, 加1.5 g商品氨(基)奈酚磺酸，搅匀使其大部分溶解(仅少量杂质不溶解)。 趁热过滤，再迅速使滤液冷却。加1 mL浓盐酸(12 mol/L),有白色氨[基]泰酚磺酸沉淀析出，过滤，并用水洗涤固体数次，再用乙醇洗涤，洗至纯白色为止，最后用乙醚洗涤，并将固体放置在暗处，使乙醚挥发，将此提纯 的氨[基]奈酚磺酸保存于棕色瓶中。取15%NaHSO4,溶液195 mL (必须透明)，加人0.5 g纯化的氨[基]奈酯磺酸及20% Na2SO3 5 mL,并在热水浴中搅拌使固体溶解(如不能全部溶解，再加20% Na2SO3溶液，每次数滴，但加入量以1 mL为限度)。置冷处可保存2-3周，如颜色变黄时， 要重新配制。
(9)二苯胺试剂:取1g纯的二苯胺溶于100mL冰乙酸(AR)中，加人2.75 mL浓硫酸， 放在棕色瓶中，此试剂也需临时配制。
(10)3,5-二羟甲苯试剂:取密度为1.19 g/cm HC 100 ml,加大FeCl, 6H;O 100 mg及二羟 甲苯100 mg.混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在使用之前新鲜配制。市售的3.5-二羟甲 苯必须用苯重结晶1~2次，用活性炭脱色方可使用。
2.器材
①离心机;②电沸水浴锅;③研钵;④剪刀;⑤玻璃棒。
1.掌握核酸的分子组成。
2.熟悉核酸的分离及鉴定方法。
[实验原理]
组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。 核蛋白被三氯乙酸沉淀后，用10%NaCl溶液提取核酸的钠盐，再加人乙醇，可使核酸钠沉淀析出。
RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、碱基(嘌呤和嘧啶)和戊糖(RNA含核糖，DNA 含脱氧核糖)此三类化合物可用下述方法鉴定:
(1)磷酸与钼酸铵作用产生磷钼酸，后者在还原剂氨蔡酚磺酸作用下形成蓝色的铜蓝
(2)嘌呤碱与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。
(3)核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糖醛，后者和3，5-二羟甲苯缩合而成绿色化合物。
脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
[实验步骤]
1.制备匀浆
将小白鼠1只拉断脊椎致死，剖腹取出全部肝组织，用清水冲净血污后，用滤纸吸干，剪刀 剪碎，再加0.9%NaCl溶液2 mL于研钵中，制成匀浆。
2.分离提取
取全部匀浆于离心管(或小试管)内;加2%三氯乙酸2 mL,用玻璃棒搅匀，静置3 min; 以3000 r/min转速离心3 min,弃去上清液，于沉淀中加人10%NaCl溶液2 mL,充分混匀，置沸水 浴中加热8 min,用玻璃棒边加热边搅拌(防止试管底破裂)，使之充分生成核酸钠化合物，冷却，以3000 r/min转速离心3 min。将上清液倒人另一试管内，逐滴加入95%冷乙醇2 mL,边加边搅拌， 待析出白色沉淀。静止5 min后，再以3000 r/min转速离心5 min,倾去上清液后沉淀备用。
3.核酸水解
于上述沉淀(核酸钠)中加人5%H2SO.4 mL。用玻璃棒搅匀，在沸水浴中加热10 min,即 得核酸水解液。
4. RNA与DNA成分的鉴定
嚯呤碱的鉴定:取中试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加人下列各试剂。
| 试管类别 | 水解液 | 5% H2SO4溶液 | 浓氨水 | 5% AgNO3溶液 |
| 测定管 | 20滴 | - | 10滴 | 10滴 |
| 对照管 | - | 10滴 | 10滴 | 10滴 |
磷酸的鉴定:取长试管2支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。
| 试管类别 | 水解液 | 5% H2SO4溶液 | 钼酸铵试剂 | 氨(基)奈酚磺酸 |
| 测定管 | 10滴 | - | 5滴 | 20滴 |
| 对照管 | - | 10滴 | 5滴 | 20滴 |
核糖的鉴定:取长试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加下列各试剂。
| 试管类别 | 水解液 | 5% H2SO4溶液 | 3,5-二羟甲苯试剂 |
| 测定管 | 4滴 | - | 6滴 |
| 对照管 | - | 4滴 | 6滴 |
脱氧核糖的鉴定:取长试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加下列各试剂。
| 试管类别 | 水解液 | 5% H2SO4溶液 | 3,5-二羟甲苯试剂 |
| 测定管 | 20滴 | - | 30滴 |
| 对照管 | - | 20滴 | 30滴 |
将2支试管同时放人德水浴中，s min后观察两管颜色差别。
[试剂与器材]
1.试剂
(1)2%三氧乙酸溶液。
(2) 95%乙醇溶液。
(3) 0.9%NaCl溶液。
(4) 10%NaCl溶液。
(5) 5% H2SO4溶液。
(6) 5% AgNO3溶液。
(7）钼酸铵试剂:在20 mL水中溶解25g钼酸铵，加5mol/L H2SO4溶液30 mL.用水稀释至100 mL.此试剂可在冰箱中保存30天。
(8)氨(基)奈酚磺酸:市售氨(基)秦酚磺酸( 1.2.4-aminonaphthal-sulfonie acid)为暗红色；可纯炼如下:在100 mL热水(90℃)中溶解15g NaHSO4及1g Na2SO4, 加1.5 g商品氨(基)奈酚磺酸，搅匀使其大部分溶解(仅少量杂质不溶解)。 趁热过滤，再迅速使滤液冷却。加1 mL浓盐酸(12 mol/L),有白色氨[基]泰酚磺酸沉淀析出，过滤，并用水洗涤固体数次，再用乙醇洗涤，洗至纯白色为止，最后用乙醚洗涤，并将固体放置在暗处，使乙醚挥发，将此提纯 的氨[基]奈酚磺酸保存于棕色瓶中。取15%NaHSO4,溶液195 mL (必须透明)，加人0.5 g纯化的氨[基]奈酯磺酸及20% Na2SO3 5 mL,并在热水浴中搅拌使固体溶解(如不能全部溶解，再加20% Na2SO3溶液，每次数滴，但加入量以1 mL为限度)。置冷处可保存2-3周，如颜色变黄时， 要重新配制。
(9)二苯胺试剂:取1g纯的二苯胺溶于100mL冰乙酸(AR)中，加人2.75 mL浓硫酸， 放在棕色瓶中，此试剂也需临时配制。
(10)3,5-二羟甲苯试剂:取密度为1.19 g/cm HC 100 ml,加大FeCl, 6H;O 100 mg及二羟 甲苯100 mg.混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在使用之前新鲜配制。市售的3.5-二羟甲 苯必须用苯重结晶1~2次，用活性炭脱色方可使用。
2.器材
①离心机;②电沸水浴锅;③研钵;④剪刀;⑤玻璃棒。
