胶层析分离法分离血红蛋白与溶菌酶
2020-05-21
[实验目的]
掌握凝胶层析分离法的原理及方法。
[实验原理]
凝胶层析又称凝胶过滤，根据样品中各种物质相对分子质量的不同，将样品通过凝胶柱来达 到分离的目的。当混合蛋白质溶液通过凝胶柱时，分子直径小于凝胶孔院的可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的不能进入。因此，小分子蛋白质在通过胶粒时受到的阻力大，流速慢:相反， 大分子蛋白质不会进人胶粒内部，可以比较顺利地通过胶粒间的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开，因此将凝胶称为“分子筛”。凝胶颗粒是多孔性的网络结构，化学性质稳定，不带电荷，吸附力很弱，制成的颗粒机械性能好，不易破碎变形，使液体在层析柱中具有较好的流速。两种分子大小不同的蛋白质混合溶液经过多孔凝胶颗粒时，小分子蛋白质进人凝胶颗粒，大分子蛋白质不能进入，因此大分子的蛋白质先被洗出。
用于凝胶过滤的凝胶，有交联葡聚糖凝胶( sephadex)、聚丙烯酰胺( bio-gel)凝胶、琼脂糖( sepharose)凝胶等。均是三度空间的网状高聚物，具有-定的孔径和交联度。根据被分离物质的分子大小、形状，可选不同类型的凝胶，交联度越小，则孔径(网眼)越大，能进人凝胶的分子就越大。根据交联度的高低，如sephadexa可分为G10~G200,其他种凝胶同样可分不同型号，见下表。
凝胶的交联度和被分离物质的相对分子质量表
掌握凝胶层析分离法的原理及方法。
[实验原理]
凝胶层析又称凝胶过滤，根据样品中各种物质相对分子质量的不同，将样品通过凝胶柱来达 到分离的目的。当混合蛋白质溶液通过凝胶柱时，分子直径小于凝胶孔院的可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的不能进入。因此，小分子蛋白质在通过胶粒时受到的阻力大，流速慢:相反， 大分子蛋白质不会进人胶粒内部，可以比较顺利地通过胶粒间的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开，因此将凝胶称为“分子筛”。凝胶颗粒是多孔性的网络结构，化学性质稳定，不带电荷，吸附力很弱，制成的颗粒机械性能好，不易破碎变形，使液体在层析柱中具有较好的流速。两种分子大小不同的蛋白质混合溶液经过多孔凝胶颗粒时，小分子蛋白质进人凝胶颗粒，大分子蛋白质不能进入，因此大分子的蛋白质先被洗出。
用于凝胶过滤的凝胶，有交联葡聚糖凝胶( sephadex)、聚丙烯酰胺( bio-gel)凝胶、琼脂糖( sepharose)凝胶等。均是三度空间的网状高聚物，具有-定的孔径和交联度。根据被分离物质的分子大小、形状，可选不同类型的凝胶，交联度越小，则孔径(网眼)越大，能进人凝胶的分子就越大。根据交联度的高低，如sephadexa可分为G10~G200,其他种凝胶同样可分不同型号，见下表。
凝胶的交联度和被分离物质的相对分子质量表
| 品名 | 型号 | 分离蛋白质的相对分子质量范围 | 品名 | 型号 | 分离蛋白质的相对分子质量范围 | |
| 交联葡聚糖凝胶 | G-10 | ＜700 | 聚丙烯酰胺 | P-2 | 200 - 1800 | |
| G-16 | ＜1500 | P-4 | 800 - 4000 | |||
| G-25 | 1000 - 5000 | P-6 | 10000 - 60000 | |||
| G-50 | 1500 - 3000 | P-10 | 1500 - 20000 | |||
| G-75 | 30000 - 70000 | P-30 | 2500 - 40000 |
注意：1r/min=0.104720rad/s
本实验使用层析床，将血红蛋白( 红色、相对分子质量64 500左右)与溶菌酶(相对分子质 量11 400左右)从混合液中分开。血红蛋白相对分子质量较大，首先被洗脱;溶菌酶相对分子质 量较小，洗脱得较慢，可用双缩脲反应检查其被洗脱的情况，用蒸馏水作溶剂。
[实验步骤]
1.凝胶的准备
称取sephadex G-50 4g置于锥形瓶中，加蒸馏水30 mL,于沸水浴中煮沸1h (此为加热法膨 胀。如在室温时膨胀，需放置3h),取出，待冷却至室温时再装柱。
2.装柱
取直径为0.8~1.5 cm,长度为17~20 cm的层析柱1支，在柱底部填少许玻璃棉或海绵圆 垫，自顶部缓缓加人稀薄的sephadex G-50悬液，开始下沉时关闭出口，待底部凝胶沉积1~2 cm 时，再打开出口，凝胶即逐层上升，加至距柱顶3 cm左右即可。操作过程中，应防止气泡与分层 现象的发生。如表层凝胶凹陷不平时，可用细玻璃棒轻轻搅动表面层，让凝胶自然沉降，使表层 平整。
3.样品制备
①血红蛋白制备。取草酸钾抗凝血液2 mL于离心管中，离心5 min,弃去上层血浆，用0.9% NaCl溶液洗血细胞2次，每次用5 mL。要把血细胞搅起，离心后尽量倒去上清液。加水5 mL,混 匀，放冰箱过夜使充分溶血;再离心( 2000 r/min) 10~ 15 min,使血细胞膜残骸沉淀，取上清透 明液放冰箱备用。②溶菌酶溶液( 150 g/L )。③取血红蛋白稀释液0.3 mL加溶菌酶0.3 mL,此混合物作为样品。
4.加样与洗脱
加样时先将出口打开，使层析床面的基馆水流出。待液面几乎平齐凝胶表层时，关团出口(不可使凝胶表层干燥).。 用移液管将样品(约0.8 mL )缓缓地沿层析柱内壁小心加于床表面，注 意尽量不使床面扰动。打开流出口，使样品进人床内，直到床面重新露出，用上法加1~2倍祥品 体积的蒸馏水(这样可使样品稀释量小，而样品完全进人床内)。当此少量蒸馏水将近流干时，反 复加人多量蒸馏水洗脱，直至两带分开为止。
5.检查
观察血红蛋白在层析床中色带位置，不断加蒸馏水洗脱。待血红蛋白洗脱完，用试管收集洗 脱液，每5滴-管，每管加20%NaOH溶液10滴、0.5%CuSO4溶液1滴(即双缩脲反应)，检查溶菌酶的洗脱情况。若为紫色，即为阳性。一般开始几管为阴性，随之为阳性，接着颜色逐渐加深，出现-一个顶峰，逐渐减弱变为阴性，表示溶菌酶已洗脱完毕。
[试剂与器材]
1.试剂
①交联葡聚糖凝胶( sephadex ) G-50;②草酸钾抗凝血液;③0.9%NaCl 溶液;④溶菌酶溶液(0.15 g/mL );⑤20%NaOH溶液;⑥0.5%0.5%CuSO4溶液。
2.器材
①水浴锅:②直径08-.5 cm、长17~-20cm层析柱;③玻璃棉或海绵圆垫;④离心机;⑤冰箱;⑥移液管。
| 品名 | 型号 | 分离蛋白质的相对分子质量范围 | 品名 | 型号 | 分离蛋白质的相对分子质量范围 | |
| 琼脂糖 | G-100 | 4000 - 150000 | 聚丙烯酰胺 | P-60 | 3000 - 60000 | |
| G-150 | 50000 - 400000 | P-100 | 500 - 150000 | |||
| G-200 | 5000 - 800000 | P-150 | 15000 - 150000 | |||
| 6B | 4×10^6 | P-200 | 30000 - 200000 | |||
| 4B | 10^4 - 2×10^7 | P-303 | 60000 - 400000 |
|||
| 2B | 10^4 - 4×10^7 |
本实验使用层析床，将血红蛋白( 红色、相对分子质量64 500左右)与溶菌酶(相对分子质 量11 400左右)从混合液中分开。血红蛋白相对分子质量较大，首先被洗脱;溶菌酶相对分子质 量较小，洗脱得较慢，可用双缩脲反应检查其被洗脱的情况，用蒸馏水作溶剂。
[实验步骤]
1.凝胶的准备
称取sephadex G-50 4g置于锥形瓶中，加蒸馏水30 mL,于沸水浴中煮沸1h (此为加热法膨 胀。如在室温时膨胀，需放置3h),取出，待冷却至室温时再装柱。
2.装柱
取直径为0.8~1.5 cm,长度为17~20 cm的层析柱1支，在柱底部填少许玻璃棉或海绵圆 垫，自顶部缓缓加人稀薄的sephadex G-50悬液，开始下沉时关闭出口，待底部凝胶沉积1~2 cm 时，再打开出口，凝胶即逐层上升，加至距柱顶3 cm左右即可。操作过程中，应防止气泡与分层 现象的发生。如表层凝胶凹陷不平时，可用细玻璃棒轻轻搅动表面层，让凝胶自然沉降，使表层 平整。
3.样品制备
①血红蛋白制备。取草酸钾抗凝血液2 mL于离心管中，离心5 min,弃去上层血浆，用0.9% NaCl溶液洗血细胞2次，每次用5 mL。要把血细胞搅起，离心后尽量倒去上清液。加水5 mL,混 匀，放冰箱过夜使充分溶血;再离心( 2000 r/min) 10~ 15 min,使血细胞膜残骸沉淀，取上清透 明液放冰箱备用。②溶菌酶溶液( 150 g/L )。③取血红蛋白稀释液0.3 mL加溶菌酶0.3 mL,此混合物作为样品。
4.加样与洗脱
加样时先将出口打开，使层析床面的基馆水流出。待液面几乎平齐凝胶表层时，关团出口(不可使凝胶表层干燥).。 用移液管将样品(约0.8 mL )缓缓地沿层析柱内壁小心加于床表面，注 意尽量不使床面扰动。打开流出口，使样品进人床内，直到床面重新露出，用上法加1~2倍祥品 体积的蒸馏水(这样可使样品稀释量小，而样品完全进人床内)。当此少量蒸馏水将近流干时，反 复加人多量蒸馏水洗脱，直至两带分开为止。
5.检查
观察血红蛋白在层析床中色带位置，不断加蒸馏水洗脱。待血红蛋白洗脱完，用试管收集洗 脱液，每5滴-管，每管加20%NaOH溶液10滴、0.5%CuSO4溶液1滴(即双缩脲反应)，检查溶菌酶的洗脱情况。若为紫色，即为阳性。一般开始几管为阴性，随之为阳性，接着颜色逐渐加深，出现-一个顶峰，逐渐减弱变为阴性，表示溶菌酶已洗脱完毕。
[试剂与器材]
1.试剂
①交联葡聚糖凝胶( sephadex ) G-50;②草酸钾抗凝血液;③0.9%NaCl 溶液;④溶菌酶溶液(0.15 g/mL );⑤20%NaOH溶液;⑥0.5%0.5%CuSO4溶液。
2.器材
①水浴锅:②直径08-.5 cm、长17~-20cm层析柱;③玻璃棉或海绵圆垫;④离心机;⑤冰箱;⑥移液管。
