蛋白质含量测定
2020-05-21
一：Folin-酚 试剂法(Lowry法)
[实验目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[实验原理]
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质.铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼 酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线， 并测定样品中蛋白质的浓度。
[实验步骤]
取试管7支，编号，按下表操作。
立即混匀，在20~25C水浴保温30 min。用660 nm比色，测定光密度值。1.操作注意事项
(1)按顺序添加试剂。
(2)试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下( 试剂甲)易被破坏，因此加试剂乙后要立即混 匀，加1管混匀1管，使试剂乙(磷钥酸)在破坏前即被还原。
2.计算
(1)绘制标准曲线。以浓度为横坐标、光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(2)以测定管光密度值查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)o
(3)再从标准管中选择1管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
[试剂与器材]
1.试剂甲
(1)4%碳酸钠(Na2CO3)溶液。
(2) 0.2 mol/L氢氧化钠溶液。
(3) 1%硫酸铜( CuSO4。H2O)溶液。
(4) 2%酒石酸钾钠(或酒石酸钾)溶液。
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50: 1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用1天，过期失效。
2.试剂乙
酚试剂，在使用前用NaOH滴定，以酚酞为指示剂，最后浓度为1mol/L。
或取NaWO4·2H20 100g和Na2MoO3 25g,溶于蒸馏水700mL中，再加85% H3PO4 50 mL和HCI(浓) 100mL,混合后，置1000 mL圆底烧瓶中温和地回流10h,再加硫酸锂一水合物150g,水50mL及溴水数滴;继续沸腾15 min后，除去剩余的溴，冷却后稀释至1000 mL,然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色租 中4℃保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后浓度为1 mol/L。
3.标准蛋白质溶液
用结晶牛血清清蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25 mg/mL的蛋白质溶液(纯度可经凯氏 定氮法确定)。
4.待测样品
准确取血清0.1 mL,置于50 mL容量瓶中，再加0.9%NaCl溶液至刻度，充分混匀。也可以 用尿液为样品。
5.器材
721℃分光光度计。恒温水浴箱
本实验方法的优缺点：
优点：灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多；重复性好.颜色深,析光度.
缺点：费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多.
二：考马斯亮蓝染色法
[实验目的]
掌握考马斯亮蓝测定蛋白质的原理和方法。
[实验原理]
考马斯亮蓝Coomassie bllint blue )测定蛋白浓度是利用蛋白质-染料结合的原理。考马 斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色:红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝 色，最大光吸收由465 nm变成595 nm。在一-定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔 定律( Beer's law),因此可以通过测定染料在595 nm处光吸收的增加量，得到与其结合的蛋白质 量。蛋白质和染料结合很快，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，可稳定1h左右，因此测 定过程必须快速。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有 弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不 断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明: NaCl、KCI、MgCl2、乙醇、(NH4)2S04不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、 乙酸、 a-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂(如Triton X-100, SDS )和玻璃去污剂均有 少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。
[实验步骤]
1.制作标准曲线
取试管5支，按下表操作，制备标准蛋白稀释系列。
另取试管6支，编号0、1-5，按下表平行操作。
将以上各试管内试液摇匀，静置2 min,于595 nm以空白管调零，读取各管A值。以标准蛋白质含量为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品测定
测定力法同上，取0.1 mL未知样品，加考马斯亮蓝溶液5mL混匀，在2~60 min内，于595 nm以空白管调零，读取A值，使其测定值在标准曲线的直线范围内，在标准曲线上查出其相 当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度( mg/mL )。
3. 注意事项
( 1 )如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5~ 20 min内测定光吸收，因为在这段时间 内颜色最稳定。
(2)测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。
[试剂与器材]
1. 试剂
(1)标准蛋白质溶液1mg/1mL。
(2)考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85% 磷酸溶液，用蒸馏水稀释至1000 mL,用滤纸过滤。最终试剂中含0.01% (W/V)考马斯亮蓝 G-250, 4.7% (W/V)乙醇溶液，8.5% (W/V)磷酸溶液。
(3)待测样品:未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1~5 mg/mL,若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液适当稀释。
2.器材
①722型分光光度计;②移液器;③移液管(0.1mL及5 mL );④试管及试管架。
本实验方法的优缺点：
优点：方法简单，只需一种显色液。反应迅速，只需一步反应，显色可在 5 min 之内完成。干扰少，许多被认为对 Lowry 法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。
缺点：线性关系不是很好。
[实验目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[实验原理]
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质.铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼 酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线， 并测定样品中蛋白质的浓度。
[实验步骤]
取试管7支，编号，按下表操作。
| 试剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 空白 | 测定管 |
| 蛋白质 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | ||
| 蒸馏水 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 1.0 | ||
| 待测样品 | 1.0 | ||||||
| 试剂甲 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 混匀，在20~25℃水浴保湿10min | |||||||
| 试剂乙 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
立即混匀，在20~25C水浴保温30 min。用660 nm比色，测定光密度值。1.操作注意事项
(1)按顺序添加试剂。
(2)试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下( 试剂甲)易被破坏，因此加试剂乙后要立即混 匀，加1管混匀1管，使试剂乙(磷钥酸)在破坏前即被还原。
2.计算
(1)绘制标准曲线。以浓度为横坐标、光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(2)以测定管光密度值查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)o
(3)再从标准管中选择1管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
[试剂与器材]
1.试剂甲
(1)4%碳酸钠(Na2CO3)溶液。
(2) 0.2 mol/L氢氧化钠溶液。
(3) 1%硫酸铜( CuSO4。H2O)溶液。
(4) 2%酒石酸钾钠(或酒石酸钾)溶液。
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50: 1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用1天，过期失效。
2.试剂乙
酚试剂，在使用前用NaOH滴定，以酚酞为指示剂，最后浓度为1mol/L。
或取NaWO4·2H20 100g和Na2MoO3 25g,溶于蒸馏水700mL中，再加85% H3PO4 50 mL和HCI(浓) 100mL,混合后，置1000 mL圆底烧瓶中温和地回流10h,再加硫酸锂一水合物150g,水50mL及溴水数滴;继续沸腾15 min后，除去剩余的溴，冷却后稀释至1000 mL,然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色租 中4℃保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后浓度为1 mol/L。
3.标准蛋白质溶液
用结晶牛血清清蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25 mg/mL的蛋白质溶液(纯度可经凯氏 定氮法确定)。
4.待测样品
准确取血清0.1 mL,置于50 mL容量瓶中，再加0.9%NaCl溶液至刻度，充分混匀。也可以 用尿液为样品。
5.器材
721℃分光光度计。恒温水浴箱
本实验方法的优缺点：
优点：灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多；重复性好.颜色深,析光度.
缺点：费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多.
二：考马斯亮蓝染色法
[实验目的]
掌握考马斯亮蓝测定蛋白质的原理和方法。
[实验原理]
考马斯亮蓝Coomassie bllint blue )测定蛋白浓度是利用蛋白质-染料结合的原理。考马 斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色:红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝 色，最大光吸收由465 nm变成595 nm。在一-定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔 定律( Beer's law),因此可以通过测定染料在595 nm处光吸收的增加量，得到与其结合的蛋白质 量。蛋白质和染料结合很快，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，可稳定1h左右，因此测 定过程必须快速。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有 弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不 断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明: NaCl、KCI、MgCl2、乙醇、(NH4)2S04不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、 乙酸、 a-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂(如Triton X-100, SDS )和玻璃去污剂均有 少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。
[实验步骤]
1.制作标准曲线
取试管5支，按下表操作，制备标准蛋白稀释系列。
| 试剂 |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 标准蛋白质溶液(mL) | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蒸馏水(mL) | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 蛋白质溶液浓度(μg/mL) | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
另取试管6支，编号0、1-5，按下表平行操作。
| 试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 不同浓度标准蛋白溶液(mL) | - | 1液0.1 | 2液0.1 | 3液0.1 | 4液0.1 | 5液0.1 |
| 蒸馏水(mL) | 0.1 | - | - | - | - | - |
| 考马斯亮蓝试剂(mL) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 标准蛋白质含量(μg/mL) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
将以上各试管内试液摇匀，静置2 min,于595 nm以空白管调零，读取各管A值。以标准蛋白质含量为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品测定
测定力法同上，取0.1 mL未知样品，加考马斯亮蓝溶液5mL混匀，在2~60 min内，于595 nm以空白管调零，读取A值，使其测定值在标准曲线的直线范围内，在标准曲线上查出其相 当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度( mg/mL )。
3. 注意事项
( 1 )如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5~ 20 min内测定光吸收，因为在这段时间 内颜色最稳定。
(2)测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。
[试剂与器材]
1. 试剂
(1)标准蛋白质溶液1mg/1mL。
(2)考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85% 磷酸溶液，用蒸馏水稀释至1000 mL,用滤纸过滤。最终试剂中含0.01% (W/V)考马斯亮蓝 G-250, 4.7% (W/V)乙醇溶液，8.5% (W/V)磷酸溶液。
(3)待测样品:未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1~5 mg/mL,若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液适当稀释。
2.器材
①722型分光光度计;②移液器;③移液管(0.1mL及5 mL );④试管及试管架。
本实验方法的优缺点：
优点：方法简单，只需一种显色液。反应迅速，只需一步反应，显色可在 5 min 之内完成。干扰少，许多被认为对 Lowry 法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。
缺点：线性关系不是很好。
