蛋白质的呈色反应和沉淀反应
2020-05-09
实验目的
掌握蛋白质和氨基酸的量色反应和沉淀反应原理。
蛋白质呈色反应
(一)双缩脲反应
[实验原理]
两分子尿素加热至180℃左右生成双缩脲并释放出一分子氨。双缩脉在碱性环境中cu与结合，生成紫红色化合物，称为双缩原反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩豚相似，也能发 生此反应，可用于蛋白质的定性或定量测定。一切蛋白质或二肽以 上的肽链都能发生双缩脲反应， 但能发生双缩豚反应的物质不一-定都是蛋白质或多肽， 有些基团如CSNH -、=C (NH2)NH-
和一CH2NH一等亦可发生。
[实验步骤]
(1)取少量尿素结晶，放在干燥试管中，用微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时， 停止加热，尿素释放氨形成双缩脲。冷却后，加10%氢氧化钠溶液约10滴，振荡混匀，再加1% 硫酸铜溶液1滴，振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成氢氧化铜的蓝 色能掩盖粉红色。
(2)取一试管加1 : 10鸡蛋白溶液约1 mL和10%氢氧化钠溶液约5滴，摇匀，再加1%硫 酸铜溶液2滴，边加边摇，观察紫红色的出现。
(二)茚三酮反应
[实验原理]
除肺氨酸、羟脯氨酸和茚三兩反应产生黄色物质外，凡含有自由氨基的化合物如氨基酸及蛋 白质都能和带三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1: 1 500 000的氨基酸水溶液即能发 生反应，是-种常用的氨基酸定量测定方法。反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基 酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
[实验步骤]
取2支试管分别加入1 : 10鸡蛋白溶液和丙氨酸溶液各1 mL,再各加0.1%茚三酮水溶液10 滴，混匀，在沸水浴中加热1~2 min,观察各管颜色变化。
二、蛋白质的沉淀反应
[实验原理]
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化膜和带同种电荷而成为稳定的亲水胶体颗粒，在 一定的理化因素影响下， 蛋白质可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
(1) 可逆沉淀:此时蛋白质分子的结构未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，仍能解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常用此类反应。
(2) 不可逆沉淀:此时蛋白质分子结构发生重大改变，蛋白质常变性面沉定，除去变性蛋白质也不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与夜固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋 白质不一定沉淀，而沉淀的蛋白质也未必变性。
(-)蛋白质的盐析
(实验原理）
当蛋白质溶于高浓度中性盐(硫酸胺、硫酸镁、氯化钠等)溶液时则蛋白质沉淀析出，称为盐析作用。盐析作用包括两种过程:①大量电解质破坏了蛋白质的水化膜，从而出现沉淀:②电解质中和蛋白质分子所带电荷而沉淀。
中性盐能否沉淀蛋白质常决定于中性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH以及蛋白质的胶体颗粒。颗粒大者比颗粒小者容易沉淀，如球蛋白多在半饱和的硫酸铵溶液中析出，清蛋白则常在饱和的硫酸铵溶液中析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低盐溶液浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
[实验步骤]
(1)加1:10新鲜鸡蛋白溶液2 mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀，静置20 min 后，观察记录实验结果。
(2)过滤、收集透明滤液。若滤液浑浊，须重复过滤至透明为止。
(3)取1 mL清滤液加固体硫酸铵使达饱和，观察实验结果。此时析出的沉淀为清蛋白。再 向浑浊液(不含硫酸铵结晶颗粒)加1.5~2.0 mL水，观察结果。
(二)重金属离子沉淀蛋白质
[实验原理 ]
蛋白质在碱性溶液中，带有较多的负电荷，当它与带正电荷的重金属离子结合时即生成不溶解的沉淀。
（实验步骤）
(1)取试管1支，加人1: 10鸡蛋白溶液iml.加人10%的HCI溶液滴再加入10%磺 基水杨酸溶液2滴，振荡试管，观察沉淀的生成。(2)另取试管1支.加入1: 10鸡蛋白溶液ImL, 加入10%的NaOH溶液1满，再加人10%磺基水杨酸溶液2滴，振荡试管，比较两个试管的变化。
(四)加热沉淀蛋白质
[实验原理 ]
由于温度升高，破坏蛋白质分子内部的化学键引起蛋白质变性，几乎所有的蛋白质都可因加 热而凝固。
蛋白质在其等电点时不带电荷，或带等量的正负电荷，此时如果升高温度则容易出现沉淀， 在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正或负电荷，较为稳定。如过酸和过碱则易变性，此时 如温度升高，虽变性却不沉淀，在冷却后，加酸或加碱调节pH达蛋白质的等电点时，则有沉 淀析出。
[实验步骤]
(1)取试管4支，编号，按下表加人试剂。
掌握蛋白质和氨基酸的量色反应和沉淀反应原理。
蛋白质呈色反应
(一)双缩脲反应
[实验原理]
两分子尿素加热至180℃左右生成双缩脲并释放出一分子氨。双缩脉在碱性环境中cu与结合，生成紫红色化合物，称为双缩原反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩豚相似，也能发 生此反应，可用于蛋白质的定性或定量测定。一切蛋白质或二肽以 上的肽链都能发生双缩脲反应， 但能发生双缩豚反应的物质不一-定都是蛋白质或多肽， 有些基团如CSNH -、=C (NH2)NH-
和一CH2NH一等亦可发生。
[实验步骤]
(1)取少量尿素结晶，放在干燥试管中，用微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时， 停止加热，尿素释放氨形成双缩脲。冷却后，加10%氢氧化钠溶液约10滴，振荡混匀，再加1% 硫酸铜溶液1滴，振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成氢氧化铜的蓝 色能掩盖粉红色。
(2)取一试管加1 : 10鸡蛋白溶液约1 mL和10%氢氧化钠溶液约5滴，摇匀，再加1%硫 酸铜溶液2滴，边加边摇，观察紫红色的出现。
(二)茚三酮反应
[实验原理]
除肺氨酸、羟脯氨酸和茚三兩反应产生黄色物质外，凡含有自由氨基的化合物如氨基酸及蛋 白质都能和带三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1: 1 500 000的氨基酸水溶液即能发 生反应，是-种常用的氨基酸定量测定方法。反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基 酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
[实验步骤]
取2支试管分别加入1 : 10鸡蛋白溶液和丙氨酸溶液各1 mL,再各加0.1%茚三酮水溶液10 滴，混匀，在沸水浴中加热1~2 min,观察各管颜色变化。
二、蛋白质的沉淀反应
[实验原理]
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化膜和带同种电荷而成为稳定的亲水胶体颗粒，在 一定的理化因素影响下， 蛋白质可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
(1) 可逆沉淀:此时蛋白质分子的结构未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，仍能解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常用此类反应。
(2) 不可逆沉淀:此时蛋白质分子结构发生重大改变，蛋白质常变性面沉定，除去变性蛋白质也不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与夜固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋 白质不一定沉淀，而沉淀的蛋白质也未必变性。
(-)蛋白质的盐析
(实验原理）
当蛋白质溶于高浓度中性盐(硫酸胺、硫酸镁、氯化钠等)溶液时则蛋白质沉淀析出，称为盐析作用。盐析作用包括两种过程:①大量电解质破坏了蛋白质的水化膜，从而出现沉淀:②电解质中和蛋白质分子所带电荷而沉淀。
中性盐能否沉淀蛋白质常决定于中性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH以及蛋白质的胶体颗粒。颗粒大者比颗粒小者容易沉淀，如球蛋白多在半饱和的硫酸铵溶液中析出，清蛋白则常在饱和的硫酸铵溶液中析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低盐溶液浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
[实验步骤]
(1)加1:10新鲜鸡蛋白溶液2 mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀，静置20 min 后，观察记录实验结果。
(2)过滤、收集透明滤液。若滤液浑浊，须重复过滤至透明为止。
(3)取1 mL清滤液加固体硫酸铵使达饱和，观察实验结果。此时析出的沉淀为清蛋白。再 向浑浊液(不含硫酸铵结晶颗粒)加1.5~2.0 mL水，观察结果。
(二)重金属离子沉淀蛋白质
[实验原理 ]
蛋白质在碱性溶液中，带有较多的负电荷，当它与带正电荷的重金属离子结合时即生成不溶解的沉淀。
重金属盐类沉淀蛋白质能引起蛋白质变性，而中性盐类即使加入量很多也不会导致蛋白质变性。
[实验步骤]
(1)取试管1支，加1: 10鸡蛋白溶液1 mL, 0.5%的NaOH溶液1滴，再加1%氯化锌溶 液1~2滴，振荡试管，观察沉淀产生。
(2)取试管1支，加入1 : 10新鲜鸡蛋白溶液1 mL,加入10% HCI 1滴混匀，再加入1%硫 酸锌溶液1~ 2滴，观察结果。比较两管溶液的变化。
(三)生物碱试剂沉淀蛋白质
[实验原理]
蛋白质溶液的pH小于等电点时，蛋白质分子带较多的正电荷，能与带负电荷的酸根离子结合而形成沉淀。
[实验步骤]
(1)取试管1支，加1: 10鸡蛋白溶液1 mL, 0.5%的NaOH溶液1滴，再加1%氯化锌溶 液1~2滴，振荡试管，观察沉淀产生。
(2)取试管1支，加入1 : 10新鲜鸡蛋白溶液1 mL,加入10% HCI 1滴混匀，再加入1%硫 酸锌溶液1~ 2滴，观察结果。比较两管溶液的变化。
(三)生物碱试剂沉淀蛋白质
[实验原理]
蛋白质溶液的pH小于等电点时，蛋白质分子带较多的正电荷，能与带负电荷的酸根离子结合而形成沉淀。
（实验步骤）
(1)取试管1支，加人1: 10鸡蛋白溶液iml.加人10%的HCI溶液滴再加入10%磺 基水杨酸溶液2滴，振荡试管，观察沉淀的生成。(2)另取试管1支.加入1: 10鸡蛋白溶液ImL, 加入10%的NaOH溶液1满，再加人10%磺基水杨酸溶液2滴，振荡试管，比较两个试管的变化。
(四)加热沉淀蛋白质
[实验原理 ]
由于温度升高，破坏蛋白质分子内部的化学键引起蛋白质变性，几乎所有的蛋白质都可因加 热而凝固。
蛋白质在其等电点时不带电荷，或带等量的正负电荷，此时如果升高温度则容易出现沉淀， 在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正或负电荷，较为稳定。如过酸和过碱则易变性，此时 如温度升高，虽变性却不沉淀，在冷却后，加酸或加碱调节pH达蛋白质的等电点时，则有沉 淀析出。
[实验步骤]
(1)取试管4支，编号，按下表加人试剂。
(2)将4支试管同时放在沸水浴中加热，观察并记录各管蛋白质出现的现象，解释变化原因。
(3)取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴人10%NaOH溶液，并观察现象。
(4)向第4管中慢慢滴人10%乙酸溶液，并观察现象。
[试剂与器材]
1. 试剂
①1 : 10新鲜鸡蛋白溶液;②尿素;③0.25%丙氨酸溶液;④0.1%茚三酮-乙醇溶液;⑤05% 氢氧化钠溶液;⑥10%氢氧化钠溶液;⑦1%氯化锌溶液;⑧10%磺基水杨酸溶液;⑨1%乙酸溶 液;①10%乙酸溶液;①10%HCl 溶液; 21%硫酸铜溶液;③硫酸铵固体;④饱和硫酸铵溶液;⑤蒸馏水。
2. 器材
①试管;②试管夹;③电炉;④酒精灯。
(3)取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴人10%NaOH溶液，并观察现象。
(4)向第4管中慢慢滴人10%乙酸溶液，并观察现象。
[试剂与器材]
1. 试剂
①1 : 10新鲜鸡蛋白溶液;②尿素;③0.25%丙氨酸溶液;④0.1%茚三酮-乙醇溶液;⑤05% 氢氧化钠溶液;⑥10%氢氧化钠溶液;⑦1%氯化锌溶液;⑧10%磺基水杨酸溶液;⑨1%乙酸溶 液;①10%乙酸溶液;①10%HCl 溶液; 21%硫酸铜溶液;③硫酸铵固体;④饱和硫酸铵溶液;⑤蒸馏水。
2. 器材
①试管;②试管夹;③电炉;④酒精灯。
